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蛋白質組學技術篇之蛋白樣品制備
2014-3-30 閱讀(4427)
蛋白質組學技術篇之蛋白樣品制備
開篇之際，首先來看看這兩句話：
“在制備中丟失的蛋白是永遠不可能在后面的實驗中彌補回來的”，
“讓我們把蛋白質看作是具有*而奇妙性質的實體”。
蛋白樣品制備是許多實驗重要的*步，蛋白樣品由于其結構特性各異，又必須使其*溶解和盡可能少的化學修飾，所以不可能有一個通用的技術，只能通過大量的實驗來積累經(jīng)驗。正如開篇所引用的兩句話中包含的深意：在研究蛋白的過程中，既需要嚴謹?shù)募夹g流程，規(guī)范的操作手段來確保蛋白研究的完整性，也需要將其看成是*而奇妙的個體，結合以往經(jīng)驗但又不拘泥于經(jīng)驗，才能真正揭開她神秘的面紗。2012年讓我們一起來回顧一下這一重要技術及值得關注的產(chǎn)品。
為什么要進行樣品制備
“為什么要進行樣品制備？電泳的目的不就是分離嗎？”剛接觸雙向電泳的小菜鳥有可能就會這么問。這個問題很好回答，這是由于目前雙向電泳一般只能分辨到1000-3000個蛋白質點(spot)，而樣品中的蛋白種類可達到10萬種以上，因此樣品的預分離制備是必須的。另外比如像對臨床組織樣本進行研究，尋找疾病標記的蛋白質組學研究目的，由于臨床樣本都是各種細胞或組織混雜，而且狀態(tài)不一，如腫瘤組織中，發(fā)生癌變的往往是上皮類細胞，而這類細胞在腫瘤中總是與血管、基質細胞等混雜。所以常規(guī)采用的癌和癌旁組織或腫瘤與正常組織進行差異比較，實際上是多種細胞甚至組織蛋白質組混合物的比較，而蛋白質組研究的通常是單一的細胞類型，因此需要進行有效的樣品制備。
但是為什么要進行不同步驟的樣品制備呢？這不僅僅是由于蛋白本身不同，所以需要不同方法來配合，而且在制備樣品的時候，首先需要明確的是什么是實驗的zui終目的：是分離盡可能多的蛋白還是分離樣品中某些感興趣的蛋白，這些直接決定了你的制備方法，也決定了實驗的成功與否。由于想要分離的蛋白必須是*溶解的，溶解的效果取決于裂解、破碎、沉淀、溶解的過程以及去污劑的選擇和各種溶液的組成，因此如果是只對樣品中的一部分蛋白感興趣，可采取預分離的方法，如欲分析的蛋白來自細胞器（細胞核、線粒體和原生質膜），則應先采取超速離心或其他方法將細胞器分離出來再溶解蛋白；如果是希望分離出盡可能多的蛋白，比如進行全蛋白質組分析，則可以將細胞或組織中的蛋白分成幾部分，分級制備。
G Biosciences 小貼士：制備的原則：
- 應使所有待分析的蛋白樣品全部處于溶解狀態(tài)（包括多數(shù)疏水性蛋白），且制備方法應具有可重現(xiàn)性。
- 防止樣品在聚焦時發(fā)生蛋白的聚集和沉淀。
- 防止在樣品制備過程中發(fā)生樣品的抽提后化學修飾（如酶性或化學性降解等）。
- *去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白。
- 盡量去除起干擾作用的高豐度或無關蛋白，從而保證待研究蛋白的可檢測性。
以上這五項原則是科學家們的經(jīng)驗智慧總結，基本上可以說是囊括了樣品制備過程中的抽象注意事項，之后還會提到具體的注意事項。
樣品制備流程
蛋白樣品制備過程簡而言之就是三步：破碎、沉淀蛋白和去除雜質。雖然說出來不過寥寥的十個字，但是這幾個過程經(jīng)過這么多年，恐怕還沒有那位研究人員可以說自己已經(jīng)*掌握，面對任何蛋白制備手到擒來。
破碎——zui小限度的減少蛋白水解和其它形式的蛋白降解原則
樣品制備的*步當然是細胞或者其它樣品的破碎，這一步看似簡單，但是操作中一旦方法不當，就有可能會丟失樣品中的蛋白和導致蛋白被修飾。要想毫發(fā)無損的通過這一關，首先就要分析樣品的來源，是易碎的細胞還是堅硬的組織？是植物細胞還是真菌？要做到有的放矢，才能事半功倍。
破碎的方法有許多種，包括循環(huán)凍融法、滲透法、去污劑法、酶裂解法、超聲波法、高壓法、液氮研磨法、機械勻漿法和玻璃珠破碎法等（可以歸納為機械法、化學法和物理法），這些方法有不同的應用范圍，基本的原則都是要以zui小的限度減少蛋白水解和其它形式的蛋白降解變性，這也就是在樣品制備破碎這一步的關鍵所在。抑制蛋白酶降解，減少操作過程溫度或者其他物理化學條件對蛋白質變性的影響，減少核酸污染對后繼電泳等分析的污染，都是破碎過程需要考慮的問題。
為了達到更好的后續(xù)抽提效果，G Biosciences發(fā)明了一種用于樣本研磨的小工具，或許可以給你帶來事半功倍的效果。EZ-Grind是一種分裝到1.5ml的研磨管中的的研磨樹脂，同時配套有研磨棒。樹脂用于zui適的研磨生物樣本從而來提取蛋白和DNA，同時樹脂是中性摩擦材質不會結合蛋白或核酸。樹脂，研磨棒，研磨管的配套組合可以破壞組織，細胞，細胞核和其他細胞器。它以做到10分鐘內一個管里可以處理100mg樣本，這個小產(chǎn)品價格不高，但是非常實用，真正想科學家之所想，建議你不妨一試，或許還有驚喜。
蛋白樣本制備的目標簡言之“三高”，保留活性高，回收產(chǎn)量高，工作效率高。“三高”是苦中作樂的說法，說的輕松，這頭一條“保留活性高”便是蛋白樣品制備的痛中之痛----樣品制備過程導致的蛋白變性和隨后的復性工作是很令人頭痛的問題。這些年來以G Biosciences為代表的以蛋白質研究為核心研發(fā)的公司開發(fā)了一系列蛋白抽提試劑，大大簡化了樣品制備工作的煩惱，更重要的是保證實驗結果的可重復性。
八仙過海，各顯神通-Focus系列抽提試劑盒，讓你的抽提不再是事兒！
針對各種常見樣本的抽提，G Biosciences旗下的Focus系列抽提試劑盒可謂是八仙過海，為你帶來了是蛋白質樣本抽提綜合解決方案。如果你的目的是研究蛋白質特性，把時間都耗在純化過程中那太費時間，看準目標，蛋白純化也可以連同初步純化一步到位。這類試劑盒通常在裂解細胞的同時利用某些共性初步分離蛋白質，令產(chǎn)品分段收集，使得在后繼的電泳分析中減少背景蛋白的復雜程度，提高蛋白電泳分辨率。下面讓我們對這些“神通”一一進行解析。
各顯神通之*式-哺乳動物蛋白質組抽提
FOCUS™ 哺乳動物蛋白質組抽提試劑盒-從哺乳動物樣本中抽提和溶解幾乎所有的蛋白，包括膜蛋白和可溶性蛋白，通過一個強烈的離液劑抽提緩沖液來溶解甚至zui難溶解的蛋白。適用于哺乳動物組織和貼壁&懸浮細胞等生物樣本。它可以一步提取實驗步驟，同時提供有一個強烈的離液劑抽提緩沖液，用于50X100mg動物組織或50微升濕細胞團樣本制備應用，從哺乳動物組織和細胞中提取總蛋白，適用于樣本制備用于2D凝膠電泳和其他應用。
各顯神通之第二式-蛋白質組分級分離
FOCUS™蛋白質組分級分離試劑盒-用來將復雜的生物樣本分級分離為胞質蛋白和膜蛋白。zui終得到的膜蛋白隨后分級分離成周邊蛋白和膜內嵌蛋白或脂筏相關的蛋白和去污劑溶解的膜蛋白。該試劑盒可以進行大于50次的實驗，它的“法力”包括：用于分級分離內嵌蛋白，周邊蛋白以及脂筏相關蛋白的組分，分級分離復雜的蛋白質組到多個組分，從組織，細胞，植物，酵母，細菌，昆蟲和其他樣本來源中分級分離得到膜蛋白，從脂筏中分級分離得到膜蛋白，用于下游的應用，包括1D和2D電泳，免疫印跡和質譜，適用于蛋白質組和細胞信號研究。
各顯神通之第三式-酵母蛋白質組抽提
FOCUS™ 酵母蛋白質組抽提試劑盒-特定性設計用于酵母研究同時提供酵母特定性的研究試劑。從酵母中抽提和溶解幾乎所有的蛋白，包括膜蛋白和可溶性蛋白。抽提是基于溫和的酵母細胞的裂解用一種酵母溶解酶。LongLife™ Zymolyase，這種酶提高了穩(wěn)定性和效期。酶反應之后是用一起提供的強烈的離液劑抽提緩沖液進行總蛋白質組的抽提，這種抽提緩沖液能夠溶解甚至是zui難溶解的蛋白。它的“法力”包括：提供有酵母特異性的溶解酶和強烈的配方的離液劑抽提緩沖液；適用于50X60微升的酵母細胞塊的制備，從酵母細胞中提取總蛋白，適用于2D凝膠電泳和其他應用的樣本制備。
各顯神通之第四式-膜蛋白抽提
FOCUS™膜蛋白抽提試劑盒-一種快速和高度重復性的方法用于從生物樣本中制備膜蛋白或疏水蛋白用于二維電泳或其他應用。膜蛋白用相分配法一步法得到抽提，抽提效率大于90%同時帶有zui小的親水蛋白污染。試劑盒提供有必要的試劑用于抽提膜蛋白以及之后的制備過程用于等電聚焦或二維電泳從而得到提高的點分辨率。它的“法力”包括：基于相分離法的膜蛋白的抽提；從組織，細胞，植物，酵母，細菌，昆蟲和其他樣本中選擇性的分級分離膜蛋白；適用于膜蛋白的制備用于一系列下游的應用，包括1D和2D電泳，免疫印跡和質譜
各顯神通之第五式-線粒體抽提
FOCUS線粒體抽提試劑盒-從培養(yǎng)的哺乳動物細胞中抽提完整的線粒體。這個試劑盒可以快速的從培養(yǎng)的哺乳動物細胞胞質組分中抽提和富集線粒體。大于90%的線粒體保持完整的內膜和外膜，從而保持功能和活性。試劑盒適用于動物組織和其他來源的線粒體抽提，可以做50次實驗，一次實驗大約是2X107哺乳動物細胞或者100mg的哺乳動物組織。它的“法力”包括：快速的分級分離線粒體活性的重組分和輕組分；適用于培養(yǎng)的動物細胞和組織；從動物細胞和組織中抽提和富集線粒體的組分；適用于下游一系列應用，包括1D和2D電泳，免疫印跡和質譜。
各顯神通之第六式-亞細胞組分抽提
FOCUS亞細胞組分抽提試劑盒-從動物細胞核組織中快速和容易的分離細胞核，線粒體，膜和胞質組分。適用于培養(yǎng)的動物細胞和動物組織。它的“法力”包括：分級分離適用于一系列下游的應用包括1D&2D電泳和免疫印跡；分離得到的線粒體大于90%是有活性的；適用于線粒體，細胞核，胞質和膜組分的分級分離。
各顯神通之第七式-信號蛋白分離富集
FOCUS信號蛋白分離富集試劑盒-從其他細胞蛋白中分級分離脂筏定位蛋白，通過采用非離子去污劑的方法。信號蛋白抽提緩沖液是的非離子去污劑配方，可以的抽提和去除可溶性蛋白，剩下包含信號蛋白的脂筏作為不溶于去污劑的組分。zui后脂筏溶解于FOCUS蛋白溶解緩沖液中，和1種2D電泳兼容緩沖液或一種其他選擇的緩沖液。該試劑盒可以用來做50次實驗，它的“法力”包括：分級分離脂筏定位蛋白；提供一個2D電泳兼容緩沖液；分離定位于脂筏上的信號蛋白；研究活化的蛋白在離開和到達脂筏的移動；適用于2D凝膠電泳，蛋白質組和細胞信號研究。
各顯神通之第八式-磷酸化蛋白富集
細胞內信號通路失調往往是引起癌變或者腫瘤發(fā)生的成因，其特征之一是信號通路成員蛋白質的可逆磷酸化。因此研究細胞信號通路各關鍵分子的磷酸化水平是分析細胞內信號傳導的研究重點之一。要從蕓蕓眾生中專門發(fā)掘磷酸化蛋白，你可能需要FOCUS Phosphorich磷酸化蛋白富集試劑盒。
FOCUS Phosphorich磷酸化蛋白富集試劑盒-一種即開即用的試劑盒，能夠從復雜的生物學樣本中富集磷酸化的蛋白和磷酸化的肽。試劑盒中含有微量離心柱，柱內的樹脂可以結合磷酸化的蛋白，結合量是每個柱子結合磷酸化的卵白蛋白大約20mg。通過再生和適當儲存，柱子可以重復利用。它的“法力”包括：使用磷酸化蛋白結合離心柱；磷酸化蛋白的迅速結合和洗脫；富集磷酸化的蛋白和肽；適合于下游一系列應用，包括1D和2D電泳，免疫印跡和質譜；適合于蛋白質組和細胞信號研究。
目前蛋白組學研究在世界尤其以中國為首的亞洲國家正如火如荼，更好的進行樣本的抽提可以為下游的工作打好堅實的基礎，FOCUS系列非常符合“三高”的理念要求，在世界*研究機構已經(jīng)使用的非常普遍，筆者建議你一試便知。
