視網(wǎng)膜色素上皮層（RPE）在維持視網(wǎng)膜穩(wěn)態(tài)和支持視網(wǎng)膜細(xì)胞（如感光細(xì)胞）方面起著關(guān)鍵作用。當(dāng) RPE 受損時，可能導(dǎo)致多種視網(wǎng)膜疾病，包括年齡相關(guān)性黃斑變性（AMD）。RPE 的損傷可由多種因素引起，如吸煙、暴露于紫外線和可見光。這些條件會產(chǎn)生活性氧（ROS），并誘導(dǎo)視網(wǎng)膜的氧化應(yīng)激。線粒體功能障礙在 AMD 中起關(guān)鍵作用，研究表明，隨著 AMD 進展，RPE 中的線粒體 DNA 損傷增加，進而導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙和視網(wǎng)膜退化。

核因子紅細(xì)胞2相關(guān)因子2（Nrf2）是一種關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞對氧化應(yīng)激的防御能力。在 RPE 細(xì)胞中，Nrf2 的激活對防止氧化損傷尤為重要，氧化損傷是視網(wǎng)膜退行性疾病發(fā)病機制的重要因素。通過增強抗氧化反應(yīng)，Nrf2 維持 RPE 細(xì)胞的功能完整性，從而在視覺功能中發(fā)揮保護作用。考慮到氧化應(yīng)激在視網(wǎng)膜疾病中的核心作用，理解 RPE 細(xì)胞中 Nrf2 的調(diào)控可能為預(yù)防或治療 AMD 等疾病的治療策略提供寶貴見解。

鑒于 RPE 細(xì)胞對 AMD 氧化應(yīng)激的易感性，針對氧化損傷和炎癥的治療方法至關(guān)重要。其中一種方法是使用色素上皮衍生因子（PEDF），該因子可在人體胎兒 RPE 細(xì)胞培養(yǎng)的條件培養(yǎng)基中鑒定。PEDF 可以保護神經(jīng)元免受氧化應(yīng)激和谷氨酸毒性的影響，在視網(wǎng)膜細(xì)胞中，它還能增加 AMD 患者抗氧化蛋白的表達。此外，PEDF 因其抗血管生成作用，可以抑制與 AMD 相關(guān)的脈絡(luò)膜新生血管形成（CNV），證實了其治療 AMD 的潛力。

以往研究已報告了胎盤來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（PD-MSCs）促進guoyanghuaqing（H2O2）-誘導(dǎo)的大鼠視網(wǎng)膜中視網(wǎng)膜層的恢復(fù)。最近，韓國 CHA 大學(xué)生命科學(xué)系、生物醫(yī)學(xué)系及醫(yī)療中心眼科團隊在一項研究中旨在比較 PD-MSCs 與具有已知治療潛力的 PEDF 因子的治療效果，并探討 PD-MSCs 是否能激活 H2O2-損傷的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞（ARPE-19）中的 Nrf2，從而發(fā)揮抗氧化作用。研究成果發(fā)表于 Antioxidants  期刊題為“Nrf2 Activated by PD-MSCs Attenuates Oxidative Stress in a Hydrogen Peroxide-Injured Retinal Pigment Epithelial Cell Line"。

為了探索 PD-MSCs 對 ARPE-19 細(xì)胞中誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的影響，將 ARPE-19 細(xì)胞用guoyanghuaqing（H2O2）處理，并與初始 PD-MSCs 共培養(yǎng)。首先，分析了與 PD-MSCs 共培養(yǎng)的 ARPE-19 細(xì)胞中 PEDF 的 mRNA 表達。與對照組相比，H2O2 處理顯著降低了 PEDF mRNA 水平，而與 PD-MSC 共培養(yǎng)則阻止了 H2O2誘導(dǎo)的降低（圖1 A）。

RPE 細(xì)胞中的脂質(zhì)代謝在維持與光感受器細(xì)胞的通訊中起著關(guān)鍵作用。然而，氧化應(yīng)激可干擾脂質(zhì)代謝，從而損害相關(guān)調(diào)控因子的正常功能。與脂蛋白相關(guān)的 ABCA1 和 ApoE 的 mRNA 表達在 H2O2 處理組中有所增加，但在 PD-MSC 共培養(yǎng)組中顯著減少（圖1 B、C）。脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）水平在 H2O2 處理組中上升，但在 PD-MSC 共培養(yǎng)組中顯著減少（圖1 D）。代表性圖像顯示出與 ABCA1 mRNA 表達相同的趨勢（圖1 E、F）。

為驗證脂滴形成，通過 BODIPY 染色分析 ARPE-19 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)由 H2O2 處理增加的脂質(zhì)形成在與 PD-MSC 共培養(yǎng)后顯著減少（圖1 G、H）。這些結(jié)果表明，PD-MSCs 抑制 H2O2 損傷的 ARPE-19 細(xì)胞中脂蛋白的形成。

圖1    PD-MSCs共培養(yǎng)減少H2O2暴露的ARPE-19細(xì)胞中的脂質(zhì)積累。

抗氧化作用對于在氧化應(yīng)激環(huán)境中維持視網(wǎng)膜穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。特別是，超氧化物歧化酶（SOD）、guoyanghuaqing酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）和過氧化物氧化還原酶（Prx）是線粒體和過氧化物酶體中的關(guān)鍵抗氧化酶（圖2 A）。接下來，為了分析 ARPE-19 細(xì)胞中的 mRNA 水平，培養(yǎng)并采集了下腔室的細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)與 H2O2 處理組相比中，HO-1、SOD1、guoyanghuaqing酶、GPx1 和 Prx3 的 mRNA 表達在 PD-MSC 共培養(yǎng)組中顯著增加（圖2 B-F）。HO-1、SOD1、guoyanghuaqing酶和 Prx3 的蛋白質(zhì)水平與 mRNA 表達呈相同趨勢（圖2 G）。

為確認(rèn) ARPE-19 細(xì)胞中內(nèi)源性 SOD1 和guoyanghuaqing酶水平，隨后分析了 ARPE-19 細(xì)胞的培養(yǎng)上清液。這些參數(shù)在 H2O2 處理組降低，但在 PD-MSC 共培養(yǎng)組中顯著增加（圖2 H、I）。

為分析 PD-MSCs 是否影響線粒體氧化應(yīng)激，使用 MitoSOX 染色檢測 ARPE-19 細(xì)胞中的線粒體超氧化物 ROS 水平，發(fā)現(xiàn)線粒體 ROS 活性在 H2O2 處理組上升，但在 PD-MSC 共培養(yǎng)組中減少（圖2 J、K）。這些結(jié)果表明，PD-MSCs 通過增強抗氧化作用來緩解氧化應(yīng)激。

圖2     PD-MSCs共培養(yǎng)通過增qiangbao露于H2O2的ARPE-19細(xì)胞中的抗氧化劑積累來減輕氧化應(yīng)激。

線粒體動力學(xué)是線粒體循環(huán)的重要機制，包括“融合"和“分裂"。線粒體融合蛋白1/2（MFN1/2）和視神經(jīng)weisuo蛋白1（OPA1）與線粒體融合相關(guān)。動力蛋白相關(guān)蛋白1（DRP1）和分裂蛋白1（FIS1）與線粒體分裂相關(guān)（圖3 A）。FIS1 的 mRNA 表達在 H2O2 處理組中有所升高，但在 PD-MSC 共培養(yǎng)組中升高幅度更大（圖3 B）。DRP1、MFN1/2 和 OPA1 的 mRNA 表達在 H2O2 處理組中減少，但在 PD-MSC 共培養(yǎng)組中顯著增加（圖3 C-F）。代表性圖像顯示出與 OPA1 mRNA 表達相同的趨勢（圖3 G、H）。

線粒體膜電位是線粒體能量儲存和活性的關(guān)鍵指標(biāo)。為分析 PD-MSCs 是否能增加線粒體膜電位，在 ARPE-19 細(xì)胞中進行了 JC-1 染色，發(fā)現(xiàn) H2O2 處理組中聚集體和單體 JC-1 的比例下降，但 PD-MSC 共培養(yǎng)組中顯著增加（圖3 I、J）。這些數(shù)據(jù)表明，PD-MSC 共培養(yǎng)通過調(diào)節(jié) H2O2 暴露的 ARPE-19 細(xì)胞的線粒體動力學(xué)來增強線粒體膜電位。

RPE 與光感受器細(xì)胞之間的視覺循環(huán)對與維生素A 相關(guān)的視覺過程至關(guān)重要。暴露于氧化應(yīng)激的 RPE 細(xì)胞會發(fā)生細(xì)胞凋亡，并表現(xiàn)出視覺循環(huán)的下調(diào)。為驗證與 PD-MSCs 的共培養(yǎng)是否能調(diào)控這些變化，進行了 Caspase-3 和 RPE65 的免疫熒光染色。切割后 Caspase-3 的表達在 H2O2 處理組顯著增加，但在 PD-MSC 共培養(yǎng)組減少。然而，RPE65 的表達則呈現(xiàn)相反趨勢。RDH11 和 RPE65 的蛋白質(zhì)水平在 H2O2 處理組中下降，但在 PD-MSC 共培養(yǎng)組中有所增加。這表明，PD-MSC 共培養(yǎng)改善暴露于 H2O2 的 ARPE-19 細(xì)胞的視覺循環(huán)。

圖3     PD-MSCs共培養(yǎng)通過調(diào)節(jié)暴露于H2O2的ARPE-19線粒體動力學(xué)來增強線粒體膜電位。

最后，為分析抗氧化酶關(guān)鍵調(diào)控因子 Nrf2 的激活，在 mRNA 表達水平上評估了 PI3K/AKT 信號通路（Nrf2的上游調(diào)控通路）。此外，還調(diào)查了 PEDF 是否能激活這一機制。

PI3K p110α 的 mRNA 表達在 H2O2 處理組中減少，但在 PD-MSC 共培養(yǎng)組中顯著增加。與 H2O2 處理組相比，單獨 PEDF 處理顯著提高了 PI3K p110α 的表達，但與 PD-MSC 共培養(yǎng)組相比差異并不顯著。然而，PD-MSCs 與 PEDF 的聯(lián)合處理顯著提高了 PI3K p110α 的表達（圖4 A）。單獨使用 PEDF 處理并未顯著增加 AKT 的表達，但是在僅與 PD-MSCs 共培養(yǎng)以及在 PD-MSCs 和 PEDf 聯(lián)合培養(yǎng)的細(xì)胞中，其上調(diào)顯著（圖4 B）。Nrf2 的 mRNA 表達與 AKT 呈相同趨勢（圖4 C）。PI3K p110α、AKT 和 Nrf2 的蛋白質(zhì)水平在 H2O2 處理組下降，但在 PD-MSC 共培養(yǎng)組中有所增加。此外，KEAP1 在 H2O2 處理組中表達升高，但當(dāng)細(xì)胞與 PD-MSCs 共培養(yǎng)時，其水平趨于下降，而 Nrf2 表達則觀察到相反的模式（圖4 D-H）。

為確定 Nrf2 活化與其主要負(fù)調(diào)控因子 KEAP1 之間的相關(guān)性，進行了免疫染色。H2O2 處理后 Nrf2 表達略有增加，但統(tǒng)計學(xué)上無顯著差異。隨后，與 PD-MSCs 的共培養(yǎng)顯著提升了 Nrf2 表達。以 KEAP1 為例，其表達在 H2O2 處理后沒有顯著變化，但與 PD-MSCs 共培養(yǎng)時表現(xiàn)出輕微下降。在 PD-MSC 共培養(yǎng)條件下，KEAP1 表達與 Nrf2 表達呈負(fù)相關(guān)（圖4 I-L）。這些結(jié)果表明，PD-MSC 共培養(yǎng)激活暴露于 H2O2 的 ARPE-19 細(xì)胞中的 Nrf2 信號通路。

圖4     PD-MSC共培養(yǎng)激活H2O2暴露的ARPE-19細(xì)胞中的Nrf2信號通路。

圖5    PD-MSCs 通過Nrf2通路增加抗氧化酶對H2O2損傷的RPE的治療作用概述。PD-MSCs通過PI3K/AKT信號通路激活Nrf2，促進抗氧化酶的表達。線粒體動力學(xué)受到調(diào)控，導(dǎo)致線粒體活性氧水平降低，線粒體膜電位穩(wěn)定。RPE再生隨著脂蛋白積累和細(xì)胞凋亡減少得到增強。

總之，該研究證明：H2O2 增加 ARPE-19 細(xì)胞中的線粒體 ROS 水平，導(dǎo)致線粒體功能障礙，還通過脂質(zhì)過氧化和積累誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；PD-MSCs 激活 Nrf2，增加抗氧化劑表達，改善線粒體功能，減少脂質(zhì)過氧化和積累，還可以通過 PI3K/AKT 信號通路調(diào)控 Nrf2。即 PD-MSCs 通過 Nrf2 介導(dǎo)的抗氧化機制來促進 H2O2 損傷的 ARPE-19 細(xì)胞的恢復(fù)。然而，PEDF 在這一過程中的直接作用仍不明確，需在各種實驗條件下進一步研究。未來還需闡明 PEDF 調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜修復(fù)的分子機制，并探索其與 PD-MSCs 的潛在協(xié)同效應(yīng)。

參考文獻：Hong SJ, Lee DH, Choi JW, Lee H, Sung Y, Kim GJ. Nrf2 Activated by PD-MSCs Attenuates Oxidative Stress in a Hydrogen Peroxide-Injured Retinal Pigment Epithelial Cell Line. Antioxidants (Basel). 2025 Oct 25;14(11):1279. doi: 10.3390/antiox14111279. PMID: 41300437; PMCID: PMC12649114.

原文鏈接：pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41300437/或點擊閱讀原文