G418溶液(geneticin,20mg/ml)

產(chǎn)品描述

新霉素(geneticin, G418)又稱遺傳霉素，是一種氨基糖苷類抗生素，能阻斷蛋白質(zhì)合成，對(duì)細(xì)菌、酵母、高等植物以及哺乳動(dòng)物細(xì)胞均有毒性，用于真核細(xì)胞從轉(zhuǎn)座子 Tn5 和 Tn601 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染新霉素(neo)抗性基因的選擇和維持，經(jīng)常用于基因轉(zhuǎn)移、基因敲除、抗性篩選以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等方面。

本產(chǎn)品經(jīng)過濾除菌，一般工作濃度為 50~1000μg/ml 不等，不同類型的細(xì)胞需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)確定*佳濃度，在具有相對(duì)穩(wěn)定基因組的細(xì)胞（如 CHO 細(xì)胞）中一旦篩選出穩(wěn)定細(xì)胞株后，無需加入 G418 即可繼續(xù)培養(yǎng)，是常用的細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染抗性篩選試劑。

訂購信息

運(yùn)輸與保存

藍(lán)冰運(yùn)輸。-20℃保存，有效期12個(gè)月。

使用方法

1.       由于每種細(xì)胞對(duì) G418 的敏感性不同，且不同批次 G418 的活性也不盡相同，所以篩選之前，需要確定 G418 的*佳篩選濃度，一般在 50~1000μg/ml 范圍內(nèi)進(jìn)行篩選。

2.       將細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液，并稀釋到 1000 個(gè)/ml。

3.       加入不同量的 G418 Solution (20mg/ml)，選擇在 10~14d內(nèi)使細(xì)胞全部死亡的*低G418 濃度來進(jìn)行下一步的篩選試驗(yàn)。

注意事項(xiàng)

1.       本產(chǎn)品科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領(lǐng)域。

2.       減少反復(fù)凍融的次數(shù)，以免失效。

3.       基因轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)后，需要一段時(shí)間才能表達(dá)出蛋白質(zhì)，所以選不宜太早。

4.       篩選也不宜太遲，一般要在轉(zhuǎn)染 24h 之后才開始加 G418 篩選，因?yàn)檗D(zhuǎn)染了外源基因的細(xì)胞代謝負(fù)荷較大，增值較慢，時(shí)間長(zhǎng)了就會(huì)被沒有外源基因轉(zhuǎn)入的細(xì)胞所淹沒，最終導(dǎo)致篩選不出陽性克隆。

5.       隨著細(xì)胞代謝，G418的濃度和活性都會(huì)下降，應(yīng)每 3~5d更換一次含有 G418 的篩選液，這時(shí)藥物濃度可以降至 200ug/ml。

6.       加藥篩選約 5~7d左右，細(xì)胞會(huì)大量死亡，為了減少死亡細(xì)胞對(duì)陽性克降的不利影響以及增加陽性克隆的獲得率，可以應(yīng)用套環(huán)法或刮除法結(jié)合有限稀釋法來篩選陽性克隆加藥后在高倍鏡下，刮除陰性克隆，消化陽性克隆后繼續(xù)篩選培養(yǎng)或者用套環(huán)套住陽性克隆，在套環(huán)內(nèi)加胰蛋白酶消化，把消化液吸到另外一個(gè)新的孔中培養(yǎng)，最后再用有限稀釋法把陽性克隆在 96 孔板中篩選。

7.       一般經(jīng)過4周左右的篩選，得到的陽性克隆都比較穩(wěn)定，但是外源基因如果沒有整合到基因組中的話，目的基因還是很容易丟失的，再次篩選往往是不可少的，經(jīng)過2次上的篩選之后才能找到遺傳穩(wěn)定的細(xì)胞克隆。

8.       注意無菌操作，盡量避免污染。