貼壁細(xì)胞需用 0.25%的消化。注意過(guò)度消化可損傷細(xì)胞。在消化時(shí)可加 2％的BSA可防止消化過(guò)度。如果用含EDTA的胰消化時(shí)，注意必須清除EDTA：在標(biāo)記前用 1×PBS或 1×binding buffer洗滌，清除EDTA，以免殘余的EDTA與Ca2+螯合，影響Annexin V的結(jié)合。
（1） 用去離子水將 10×Binding Buffer 稀釋成 1×Binding Buffer；
（2） 細(xì)胞收集：懸浮細(xì)胞收集：離心 5 分鐘；貼壁細(xì)胞：用不含EDTA的胰消化收集后（ 注：胰消化時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，否則會(huì)影響細(xì)胞膜上磷脂酰絲氨與Annexin V-FITC 的結(jié)合），在室溫中，2000rpm 離心 5～10 分鐘，收集細(xì)胞；
（3） 細(xì)胞洗滌：用預(yù)冷 1×PBS（4℃）重懸細(xì)胞一次，2000rpm 離心 5～10分鐘，棄上清洗滌細(xì)胞；
（4） 加入 300μL 的 1×Binding Buffer 懸浮細(xì)胞；
（5） Annexin V-FITC 標(biāo)記：加入 5μL 的 Annexin V-FITC 混勻后，避光，室溫孵育 15 分鐘；
（6） PI 標(biāo)記：上機(jī)前 5 分鐘再加入 5μL 的 PI 染色。
（7） 上機(jī)前，補(bǔ)加 200μL 的 1×Binding Buffer。
注意：每個(gè)反應(yīng)體系建議細(xì)胞數(shù)為1×104至1×106個(gè)

（1） 使用前低速離心，以免液體積存管蓋和管壁；
（2） 本試劑只適用于實(shí)驗(yàn)，不適用于臨床檢測(cè)；
（3） PI（propidium iodide，溴化丙錠）有毒性，能通過(guò)皮膚吸收，對(duì)眼睛有刺激作用，使用時(shí)需戴手套；
（4） Annexin V-FITC 和 PI 是光敏物質(zhì)，在操作時(shí)請(qǐng)注意避光。在處理和標(biāo)記時(shí)，盡可能在暗處進(jìn)行。在孵育階段，用鋁箔包裹容器或置于抽屜中。細(xì)胞標(biāo)記后，在暗室內(nèi)用顯微鏡觀察；
（5） 整個(gè)操作過(guò)程動(dòng)作要盡量輕柔，勿用力吹打細(xì)胞，盡量在 4℃下操作，以免影響細(xì)胞狀態(tài)。
（6） 在細(xì)胞洗滌的最后一步，請(qǐng)盡量將上清棄凈，以免 PBS 殘留，有可能會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
（7） 為防止熒光衰變，宜在 1 小時(shí)內(nèi)進(jìn)行流式檢測(cè)。
（8） PI 染色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)有可能造成檢測(cè)的凋亡率偏高，建議首先進(jìn)行Annexin V-FITC 染色，最短可在上機(jī)前 5 分鐘再加入 PI 染色。

Annexin V-FITC apoptosis assay kit

4℃保存6個(gè)月；避免反復(fù)凍融。