GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）是糖酵解途徑中的關(guān)鍵代謝酶，催化甘油醛-3-磷酸氧化磷酸化為1,3-二磷酸甘油酸。除了經(jīng)典的代謝功能外，GAPDH 還參與囊泡運(yùn)輸、DNA 修復(fù)、DNA 復(fù)制、細(xì)胞骨架調(diào)控及 tRNA 核輸出等非代謝過程，常作為 Western Blot 和免疫組織化學(xué)中的內(nèi)參蛋白使用。由艾美捷Bethyl Laboratories推出的兔抗GAPDH抗體親和純化抗體（貨號：A300-639A ） 經(jīng)抗原親和純化，特異性識別 人 GAPDH 蛋白第 150–200 位氨基酸 區(qū)域，適用于免疫組織化學(xué)（IHC）和免疫印跡（WB），并交叉識別人和小鼠 GAPDH。本文基于詳細(xì)產(chǎn)品規(guī)格，從基本特性、免疫原設(shè)計、實(shí)驗(yàn)優(yōu)化流程、功能背景及常見問題排查等方面提供系統(tǒng)性技術(shù)參考。

一、產(chǎn)品基本規(guī)格與儲存信息

參數(shù)| 內(nèi)容

靶標(biāo)| GAPDH（G3PD）

反應(yīng)性| 小鼠、人類

應(yīng)用| IHC、WB

宿主/克隆性  | 兔 / 多克隆

形式| 完整 IgG

免疫原| 第175至225位氨基酸之間（具體表位位于第150–200位）

亞型| IgG

標(biāo)記物| 未標(biāo)記

純度| 抗原親和純化

抗原種屬 | 人類

濃度| 200 µg/ml

保存條件 | 2?–?8?°C

有效期| 自收貨之日起 1 年

緩沖液| Tris-緩沖鹽水，含 0.1% BSA 及 0.09% 疊d化鈉

儲存與操作提示：  

抗體須始終保存于 2–8?°C，嚴(yán)禁冷凍，冷凍會導(dǎo)致蛋白聚集和效價下降。  

緩沖液中含有 0.1% BSA 作為穩(wěn)定蛋白，有助于提高稀釋后的抗體穩(wěn)定性；疊d化鈉為防腐劑，可能抑制 HRP 活性，若用于活細(xì)胞實(shí)驗(yàn)需去除。  

抗體濃度為 200?µg/ml，較常見內(nèi)參抗體略低，使用時注意稀釋倍數(shù)計算。  

濃度采用比爾定律標(biāo)定（A280?=?1.4 對應(yīng) 1?mg/mL IgG）。

二、推薦應(yīng)用與實(shí)驗(yàn)條件

免疫印跡（Western Blot, WB）

推薦稀釋范圍：1:2,000 – 1:10,000  

封閉液與抗體稀釋液：5% 脫脂牛奶 / TBST  

一抗孵育：4?°C 過夜（或室溫 2 小時）  

二抗推薦：Goat anti?Rabbit IgG (H+L) HRP（A120-101P）  

檢測方式：增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光（ECL），也可使用顯色法（如 DAB）

WB 優(yōu)化流程（作為內(nèi)參或檢測目標(biāo)蛋白）

1. 樣本制備：  

陽性對照：HeLa、HEK293、NIH/3T3、小鼠肝臟或腦組織裂解液。  

裂解液：RIPA 或 SDS 上樣緩沖液均可（GAPDH 高度穩(wěn)定）。  

上樣量：5–10?μg 總蛋白 即可獲得強(qiáng)信號（內(nèi)參常用量）。

2. 電泳：使用 10–12% SDS?PAGE（GAPDH 分子量約 36?kDa）。  

3. 轉(zhuǎn)印：PVDF 或硝酸纖維素膜，250?mA 恒流 60 分鐘。  

4. 封閉：5% 脫脂牛奶 / TBST，室溫 30–60 分鐘。  

5. 一抗孵育：用 5% 牛奶 / TBST 按 1:2,000 – 1:10,000 稀釋（s次建議 1:5,000）。  

6. 洗滌：TBST 洗滌 3?×?10 分鐘。  

7. 二抗孵育：HRP?山羊抗兔（1:10,000–1:20,000），室溫 45 分鐘。  

8. 洗滌后 ECL 檢測。

預(yù)期結(jié)果：應(yīng)在約 36?kDa 處檢測到一條清晰、均一的條帶。GAPDH 表達(dá)豐度j高，過度曝光或上樣量過大可能導(dǎo)致條帶過飽和或拖尾，建議使用較短的曝光時間（如 1–30 秒）。

作為內(nèi)參的注意事項(xiàng)

GAPDH 表達(dá)在不同組織、細(xì)胞類型及處理?xiàng)l件下可能存在差異（如缺氧、高糖、某些藥物處理），實(shí)驗(yàn)設(shè)計中應(yīng)設(shè)置合適的對照。  

對于代謝相關(guān)研究，建議同時使用另一種內(nèi)參（如 β?actin 或 Tubulin）進(jìn)行驗(yàn)證。  

該抗體在 WB 中特異性高，背景干凈，適合用于定量分析。

免疫組織化學(xué)（Immunohistochemistry, IHC）

推薦稀釋范圍：1:500 – 1:2,000  

抗原修復(fù)：檸檬酸鈉緩沖液（pH 6.0），微波或高壓熱修復(fù) 10–15 分鐘。  

樣本類型：福爾馬林固定、石蠟包埋（FFPE）的人或小鼠組織切片。  

封閉：5% 正常血清 / PBS 或 3% BSA / PBS，室溫 30 分鐘。  

檢測：HRP/DAB 顯色或熒光二抗。

IHC 實(shí)驗(yàn)流程要點(diǎn)

1. 脫蠟與水化：常規(guī)二甲苯、梯度乙醇處理。  

2. 抗原修復(fù)：推薦使用檸檬酸緩沖液 pH?6.0，高壓鍋修復(fù) 2–3 分鐘或微波煮沸 15 分鐘。冷卻至室溫。  

3. 通透（可選）：0.2% Triton X?100 / PBS，10 分鐘（若檢測膜/核抗原）。  

4. 封閉：5% 正常山羊血清 / PBS，室溫 30 分鐘。  

5. 一抗孵育：用封閉液稀釋抗體至 1:500–1:2,000（s次推薦 1:1000），4?°C 過夜。  

6. 洗滌：PBS 洗滌 3?×?5 分鐘。  

7. 二抗孵育：HRP 或熒光標(biāo)記抗兔二抗，室溫 1 小時。  

8. 顯色：DAB（棕色）/ AEC（紅色）或熒光封片。

預(yù)期染色模式：GAPDH 在細(xì)胞質(zhì)中廣泛表達(dá)（部分細(xì)胞核也有表達(dá)），IHC 染色應(yīng)為胞質(zhì)均一陽性。建議使用腎、肝或腫瘤組織作為陽性對照，胞質(zhì)無染色作為陰性對照（如僅用二抗）。