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一.細(xì)胞培養(yǎng)的基本原理
細(xì)胞培養(yǎng)是用酶消化法將組織碎塊分離成單個(gè)細(xì)胞，用培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，在體外適宜條件下，使細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖，并保留其一定的結(jié)構(gòu)和功能特性。細(xì)胞培養(yǎng)與組織培養(yǎng)、器官培養(yǎng)主要不同點(diǎn)在于原始培養(yǎng)的對(duì)象不同。細(xì)胞培養(yǎng)使用的是單個(gè)細(xì)胞懸液，組織培養(yǎng)使用的是組織塊(0．5～1立方毫米)或薄片(厚0．2毫米)，而器官培養(yǎng)使用的是器官原基或器官的一部分或整個(gè)器官。在組織培養(yǎng)中，細(xì)胞自組織塊周圍移出并生長(zhǎng)，細(xì)胞在生長(zhǎng)過程中總有移動(dòng)(運(yùn)動(dòng))或其它變動(dòng)，這樣就使被培養(yǎng)的組織難以長(zhǎng)期維持其原有的結(jié)構(gòu)和功能。培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，發(fā)生變化的可能性越大，結(jié)果常使單一類型的細(xì)胞保存下來，終成了細(xì)胞培養(yǎng)。在細(xì)胞培養(yǎng)中，細(xì)胞生命活動(dòng)和體內(nèi)細(xì)胞一樣，仍然是相互依存的，呈現(xiàn)一定的組織特異性，所以組織培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)際上無嚴(yán)格區(qū)別。
細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是生命科學(xué)中常用的研究手段，該方法能排除神經(jīng)體液因素的影響及肝、腎解毒功能的干擾，觀察某些因素或藥物對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的直接作用。通過實(shí)驗(yàn)可獲得某一類型細(xì)胞的純培養(yǎng)。如心肌組織中心肌細(xì)胞約占50％，非心肌細(xì)胞占50％；而經(jīng)純化分離的心肌細(xì)胞懸液中，心肌細(xì)胞可達(dá)95％以上，這樣，心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)基本不受其它細(xì)胞的干擾。在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中能直接觀察到培養(yǎng)細(xì)胞生命活動(dòng)的動(dòng)態(tài)過程；用定時(shí)顯微攝影記錄可發(fā)現(xiàn)一些肉眼觀察不到的生命現(xiàn)象；還可利用電鏡手段、同位素標(biāo)記、放免法和免疫組化法等來研究細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及細(xì)胞內(nèi)化學(xué)物質(zhì)的分布。此外，還能節(jié)約研究費(fèi)用。如在某些研究中，用100只動(dòng)物做實(shí)驗(yàn)所獲得結(jié)論與用100張蓋玻片或幾十個(gè)培養(yǎng)瓶而獲得結(jié)論具有相同的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而細(xì)胞培養(yǎng)較之大批量的動(dòng)物飼養(yǎng)花費(fèi)要小。
但細(xì)胞培養(yǎng)方法也存在不足之處：培養(yǎng)細(xì)胞失去體內(nèi)細(xì)胞的制約和整體的調(diào)節(jié)作用，細(xì)胞形態(tài)和功能會(huì)發(fā)生一定程度的改變。培養(yǎng)方法、實(shí)驗(yàn)試劑對(duì)細(xì)胞形態(tài)和功能有一定的影響，如胰蛋白酶可破壞細(xì)胞表面受體、酶、抗原等。長(zhǎng)期體外培養(yǎng)的細(xì)胞，由于反復(fù)傳代、凍存和操作等因素的影響，可能發(fā)生染色體非整倍體改變，呈永生化或癌變的特征。
二.細(xì)胞培養(yǎng)的基本設(shè)備與用品
(1)細(xì)胞培養(yǎng)的基本設(shè)備
細(xì)胞培養(yǎng)的基本設(shè)備有：CO2培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡，凈化臺(tái)，壓力蒸汽消毒器，自動(dòng)雙重純水蒸餾器，液氮罐，冰箱，電熱干燥箱，電熱恒溫培養(yǎng)箱，電動(dòng)吸引器，抽氣泵等。
(2)常用的實(shí)驗(yàn)用品
1.玻璃器皿
細(xì)胞培養(yǎng)所用的玻璃器皿應(yīng)由透明度好、無毒的中性硬質(zhì)玻璃制成。常用的有以下幾種：國產(chǎn)螺旋口培養(yǎng)瓶[有12．5毫升，25毫升，100毫升等規(guī)格，國外培養(yǎng)瓶常以底面積(平方厘米)表示]；培養(yǎng)皿(直徑有3．5厘米，6厘米，9厘米，10厘米等規(guī)格)；離心管(5毫升，10毫升)；注射器(1毫升，5毫升等)；用生理鹽水瓶代替的貯存瓶(100毫升，250毫升，500 毫升)；青霉素瓶(5毫升)；西力辛瓶(10毫升)；其它還有尖吸管和移液管，載玻片(厚度0．8～1．2毫米)，蓋玻片(厚度0．12毫米)，貯存尖吸筒用的玻璃筒或金屬筒，漏斗，燒杯，量筒，貯蒸餾水瓶，冷凍管(1．5毫升，2毫升)等。
2.塑料品
多孔培養(yǎng)板規(guī)格有4、6、12、24、96孔等，培養(yǎng)皿直徑有3厘米、6厘米、10厘米等。塑料品經(jīng)消毒滅菌密封包裝，供一次性使用，重復(fù)使用的需經(jīng)特殊方法清洗消毒。塑料器材厚薄均勻，有的表面經(jīng)特殊處理，細(xì)胞易于生長(zhǎng)。
3.器械
解剖刀、眼科剪和鑷(直頭和彎頭)、中號(hào)圓頭鑷、止血鉗等。
4.雜用品
金屬飯盒、試管架、各種規(guī)格膠塞、記號(hào)筆、搪瓷盤、吸頭(吸取液體的膠帽)、酒精燈、酒精、碘酒棉球瓶、火柴等。
組織培養(yǎng)中使用多的是吸管、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿及各種瓶塞。實(shí)驗(yàn)者手中應(yīng)有三套器材，瓶塞數(shù)要大于瓶數(shù)，才能保證實(shí)驗(yàn)中的循環(huán)使用。
三.細(xì)胞培養(yǎng)用品的清洗與消毒滅菌
(1)清 洗
1.常用玻璃器皿清洗
◇清洗要領(lǐng)
浸泡
初次使用的玻璃器皿呈堿性，表面常附有灰塵和一些對(duì)細(xì)胞有毒的物質(zhì)，如鋁和砷等。空氣濕度高時(shí)，玻璃器皿表面又易長(zhǎng)霉。使用前，新器皿浸泡在5％稀鹽酸中過夜，以中和玻璃表面的堿性物質(zhì)并去除霉斑；然后經(jīng)簡(jiǎn)單刷洗，流水沖洗(逐片進(jìn)行)，蒸餾水浸泡，干燥備用。新玻片處理后，短時(shí)間不用時(shí)，需將它投入95％的酒精中保存，以防玻片長(zhǎng)霉。培養(yǎng)后的玻璃器皿應(yīng)立即投入清水中浸泡，器皿中殘留的細(xì)胞、蛋白質(zhì)一旦干涸，即固著于玻璃表面，極難脫落。
刷洗
用過的玻璃器材經(jīng)自來水沖洗后，浸入水中煮沸，然后將適量洗滌劑(洗潔精或洗衣粉)投入沸水中繼續(xù)煮沸10分鐘，趁熱刷洗器皿內(nèi)外，刷洗后浸入清水中進(jìn)行沖洗。
酸泡
刷洗好的玻璃器材干燥后置清潔液中浸泡24小時(shí)，清潔液的強(qiáng)氧化作用可清除刷洗不掉的極微量雜質(zhì)。
◇清洗步驟
玻璃器材煮沸10分鐘→刷洗→流水振蕩沖洗15-20遍→50℃烤干→清潔液浸泡24小時(shí)→流水振蕩后沖洗15-20遍→漓水→蒸餾水浸泡2次(每次24小時(shí))→50℃烤干，待包裝。
◇清洗注意事項(xiàng)和要求
①使用后的實(shí)驗(yàn)器材應(yīng)立即投入清水中。
②浸泡、煮沸、酸泡的器皿內(nèi)要充滿液體，不得有氣泡。
③刷洗、酸泡后的器材要用流水振蕩沖洗，不得殘留洗滌劑、清潔液。方法是：每瓶灌2／3容積的自來水，振蕩后倒掉，重復(fù)15—20次(尖滴管置量杯中沖洗)。
④煮沸前的水面要高于器材5厘米，水沸后投入洗滌劑(直徑35厘米的鋁鍋，用洗衣粉10克左右)。若洗滌劑和實(shí)驗(yàn)器材同時(shí)從冷水煮至沸騰或使用過量洗劑，均易腐蝕玻璃表面，使玻璃堿化，pH值上升。
⑤軟毛刷的刷端已掉毛的應(yīng)該棄去，否則會(huì)損害玻璃。玻璃劃痕處易殘留洗滌劑，會(huì)改變培養(yǎng)液pH值和毒害細(xì)胞。
⑥清潔物品應(yīng)及時(shí)包裝消毒，應(yīng)注意妥善保存，防止落入灰塵、蟑螂、螞蟻等引起二次污染。
⑦使用后的膠塞與玻璃器材同時(shí)煮洗時(shí)，膠塞要放在煮鍋的底部。
⑧浸泡器材的蒸餾水容器要，并做好標(biāo)記，如“蒸餾水Ⅰ盆”、“蒸餾水Ⅱ盆”。
⑨器材清洗干燥后，在以后各步操作時(shí)，手指不可接觸器材的使用端。清洗者可戴一次性薄膜手套進(jìn)行操作，省時(shí)又保證清洗質(zhì)量。
⑩用超聲波儀清洗器材時(shí)，清洗要求同上。
2.橡膠制品的清洗
新購置的橡膠制品(膠塞、膠管、橡皮乳頭)的洗滌方法如下：0．5摩爾/升NaOH煮沸15分鐘→流水沖洗→0．5摩爾/升HCl煮沸15分鐘→流水沖洗→自來水煮沸2次→蒸餾水煮沸20分鐘→50℃烤干備用。這樣處理可*除凈膠塞上的硫磺等有毒物質(zhì)。用過的膠塞，其清洗方法、要求基本同玻璃器材。因膠塞使用面常沾有洗滌劑，流水沖不凈，故膠塞洗刷的重點(diǎn)部位是膠塞使用面，用刷逐個(gè)刷洗。在使用過程中，膠塞不能與培養(yǎng)液接觸，以防未洗凈的膠塞污染培養(yǎng)液和細(xì)胞。
3．G6除菌濾器的清洗
新G6除菌濾器置玻璃洗液中浸泡24小時(shí)，流水緩慢沖洗，至pH值為5．5左右，然后用4倍的蒸餾水緩慢沖洗，再用重蒸餾水緩慢沖洗，烤干，包裝消毒備用。用過的G6除菌漏斗立即浸泡水中(注意：濾器千萬不能干涸)過夜，流水緩慢沖洗24小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間，至濾面基本疏通時(shí)，50℃烤干，濾器再置清潔液中浸泡24小時(shí)，或裝滿清潔液自然過濾。流水沖洗及其后的處理同新G6除菌濾器。
4.正壓除菌濾器的清洗
新的或使用后的正壓濾器經(jīng)稀洗滌劑刷洗水沖洗15分鐘→漓水→去離子水浸泡24小時(shí)→三蒸水浸泡24小時(shí)→干燥備
5.塑料制品的清洗
塑料制品質(zhì)地軟且耐腐蝕能力強(qiáng)，但不耐熱，易出現(xiàn)劃痕。其清洗程序?yàn)椋浩髅笥煤罅⒓从昧魉疀_洗→浸于自來水中過夜→用紗布、棉簽和50℃稀洗液刷洗→流水沖洗(人工沖洗15—20遍)→晾干→浸于清潔液中15分鐘→流水沖洗→蒸餾水浸泡兩次(每次24小時(shí))→晾干備用。
6.清洗液的配制
清潔液
新配制的清潔液為棕紅色，遇有機(jī)溶劑或水分增多時(shí)變成綠色，表明失效。
先在搪瓷盆中加入蒸餾水，加熱溶解重鉻酸鉀，再將盆置流 動(dòng)自來水中，待重鉻酸鉀液冷卻后，緩慢加入濃硫酸，邊加邊用玻棒攪動(dòng)，以混合液溫度不過快上升和不出現(xiàn)重鉻酸鉀結(jié)晶為度。
玻璃濾器洗液
取10克硝酸鈉和28．6毫升濃硫酸，放入盛有470毫升蒸餾水的玻璃缸內(nèi)混勻備用。
清潔液配方
配方成分
常用方
弱液
次強(qiáng)液
強(qiáng)液
重鉻酸鉀（g）
100
50
100
60
清水（ml）
800
1000
1000
200
濃硫酸（ml）
200
90
160
800
硫酸濃度（v/v）
20%
8%
14%
80%
(2)消毒滅菌
1.濕熱消毒
◇濕熱消毒的要求
使用壓力蒸汽滅菌器進(jìn)行濕熱消毒。
①消毒物品不能裝得太滿，物品之間應(yīng)留有空隙，以利于消毒器內(nèi)蒸汽的流動(dòng)。
②排氣管要插入消毒器的槽內(nèi)。若排氣管斷裂，要將排氣管與排氣閥調(diào)至同一位置。
③玻璃器材使用端(管口、瓶口)要向下放置。
④液體消毒時(shí)，用棉塞或插有針頭的膠塞封瓶口。
⑤加熱前將放氣閥摘子置垂直位(開放)，消毒器內(nèi)空氣隨溫度升高由此閥孔逸出，容器內(nèi)冷空氣隨之排出。當(dāng)水煮沸時(shí)，有一股較急的蒸汽沖出時(shí)，將放氣閥摘子置水平位(關(guān)閉)。排除冷空氣的另一種方法是：放氣閥摘子置水平位(關(guān)閉)，加熱，壓力升至5磅時(shí)，將摘子置垂直位(開放)，冷、熱空氣先后排出(可用手試)。待壓力指針回歸零位時(shí)，放氣閥摘子再置水平位(關(guān)閉)。
⑥繼續(xù)加熱，當(dāng)消毒器內(nèi)升壓至需要壓力時(shí)，計(jì)時(shí)并使壓力恒定。壓力維持方法：用電加熱時(shí)，可通過電源和滅菌器間的穩(wěn)壓器調(diào)節(jié)；沒有穩(wěn)壓器時(shí)，用放氣閥摘子自動(dòng)排氣調(diào)節(jié)；用煤氣加熱時(shí)，可調(diào)節(jié)火力維持壓力。根據(jù)消毒物品種類不同所選擇的消毒壓力和時(shí)間也不同，一般物品(如布類、金屬器械、玻璃器皿等)消毒的要求是15磅20分鐘；橡膠制品為10磅10分鐘；常規(guī)液體消毒15磅15分鐘。一般認(rèn)為在這種壓力下1分鐘內(nèi)幾乎可殺死所有微生物，但由于消毒物品的包裝內(nèi)仍可能留有冷空氣，而使高壓蒸汽不能達(dá)到消毒器的各部分，所以要延長(zhǎng)消毒時(shí)間。
⑦消毒完畢，待壓力指針降至零位，再等數(shù)分鐘，待放氣閥摘子放完氣后打開消毒器蓋。液體瓶口棉塞換膠皮塞或拔去膠皮塞針頭換新塞。
◇濕熱消毒的注意事項(xiàng)
①不可用安全閥摘子排氣。
②消毒的過程中若出現(xiàn)漏氣現(xiàn)象，可調(diào)節(jié)消毒器蓋內(nèi)的膠墊的位置。
③滅菌完畢，不要急于取出消毒，可利用消毒器的余熱去除物品部分濕氣，待半小時(shí)左右再移入干燥箱烘干。
這種消毒方法主要用于玻璃器皿消毒，一般溫度在160℃維持90—120分鐘就可以殺死芽胞，達(dá)到消滅包括細(xì)菌、芽孢在內(nèi)的一切微生物的目的，還可破壞熱原質(zhì)。消毒完畢，待烘箱內(nèi)溫度冷卻后再開門，避免因冷空氣突然進(jìn)入，烘箱內(nèi)溫度驟降引起玻璃器皿損壞。
紫外線直接照射消毒是各實(shí)驗(yàn)室常用的方法，主要用于培養(yǎng)室空氣、操作臺(tái)、塑料培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等表面消毒。進(jìn)行室內(nèi)消毒時(shí)，紫外線燈應(yīng)距地面2．5米，使各處有0．06微瓦能量的照射。當(dāng)室內(nèi)有塵土?xí)r，殺菌能力減弱，故其消毒環(huán)境應(yīng)清潔無塵，并要求消毒空氣濕度小于50％，才能達(dá)到殺菌效果。紫外線消毒時(shí)產(chǎn)生臭氧，對(duì)身體有害，故紫外線消毒停止后30分鐘才可入室工作。目前有的實(shí)驗(yàn)室采用電子滅菌燈代替紫外燈進(jìn)行空氣消毒。
大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、酶液等均采用濾過法除菌。常用的除菌濾器有正壓式和負(fù)壓式兩種。
◇正壓式(加壓式)濾過消毒。
正壓式除菌濾器為金屬結(jié)構(gòu)，中間墊一種特制的混合纖維素酯微孔濾膜，其過濾速度較快，效果較好，被多數(shù)實(shí)驗(yàn)室采用。濾膜孔徑有0．6微米、0．45微米、0．22微米三種規(guī)格。濾過除菌時(shí)，常使用0．22微米孔徑的濾膜。濾器上下層各有一槽，放置硅膠墊圈，將濾膜壓緊固定。
濾膜使用時(shí)應(yīng)注意：
①濾膜薄且光滑，容易移動(dòng)，安裝時(shí)膜位置一定要放正。過分干燥的濾膜很脆，在高壓或高溫干燥時(shí)易破裂，因此安裝前可先用三蒸水潤濕濾膜。
②為保證過濾效果，在使用時(shí)，每次墊兩張濾膜，上面一張孔徑為0．45微米，下面一張孔徑為0．22微米，或兩張均為0．22微米。
③使用無齒玻片鑷子夾取濾膜，以防止鑷齒弄破濾膜。
④加大壓力時(shí)用力應(yīng)均勻，用后打開濾器對(duì)光檢查濾膜是否移動(dòng)和有無破裂。
⑤濾器濕熱消毒，37℃干燥。濾膜用后丟棄。若過濾少量液體，可將小型針頭濾器安裝在注射器上使用。目前許多廠家有一次性針頭濾器出售。國產(chǎn)針頭濾器易污染。
⑥不同廠家的濾膜質(zhì)量有差異。
◇負(fù)壓式濾過消毒
負(fù)壓式濾過消毒常使用玻璃濾器。玻璃濾器以燒結(jié)玻璃濾板固定在一玻璃漏斗上做成，適于各種培養(yǎng)液的濾過除菌，但不宜濾過血清等粘稠液體，因?yàn)槿菀锥氯麨V板孔。根據(jù)濾板孔徑大小分為G0—G6幾種規(guī)格，一般使用G6型(孔徑為0．22微米)除菌。玻璃濾器漏斗接抽濾瓶，膠管連接抽濾瓶和抽氣瓶，抽氣瓶再與真空抽氣泵相連，或 抽濾瓶用膠管與玻璃水泵相連。負(fù)壓式濾過消毒的缺點(diǎn)是濾速較慢，清洗過程繁瑣。
負(fù)壓式除菌濾器安裝使用注意事項(xiàng)：
①漏斗與抽濾瓶連接部位要旋緊，并用消毒布包緊連接部位，以保證瓶口不漏氣。
②當(dāng)抽濾瓶?jī)?nèi)有負(fù)壓形成時(shí)，先夾緊抽濾瓶下口與抽氣瓶連接的膠管，再緩慢停止抽氣，防止有菌空氣倒回，污染濾液。自然濾過一段時(shí)間，待流速減慢可再行抽氣。
③當(dāng)漏斗中剩余液體為50～100毫升時(shí)，夾緊下口膠管停止抽氣，空氣隨液體自然濾過消毒進(jìn)入瓶?jī)?nèi)，瓶?jī)?nèi)壓力升高，真空解除。
④拆除真空泵和抽氣瓶連接裝置，拆除漏斗與抽濾瓶連接部包布。
⑤漏斗與抽濾瓶連接部位在火焰前方均勻燒灼后，兩者分開，抽濾瓶斜放在超凈臺(tái)上，瓶口順風(fēng)向。
75％酒精、新潔爾滅、過氧乙酸、乳酸和洗必泰等都是常用的有效消毒劑。0．5％的過氧乙酸在10分鐘內(nèi)可將芽孢菌和各種病毒殺死；乳酸蒸汽常用做無菌室內(nèi)或周圍環(huán)境的定期消毒；75％酒精常用于超凈臺(tái)的臺(tái)面、器械、實(shí)驗(yàn)操作者的皮膚等的消毒，0．1％新潔爾滅用于對(duì)桌、椅、地面、皮膚、操作臺(tái)面進(jìn)行擦拭或浸泡消毒；0．1％洗必泰水溶液用于皮膚浸泡消毒。
塑料器皿不耐高溫，清洗干凈后用75％酒精(分析純)浸泡過夜，滅菌三蒸水浸泡兩次，每次10分鐘，紫外線照射1小時(shí)，再經(jīng)細(xì)胞基礎(chǔ)營養(yǎng)液浸泡過渡后，供短期內(nèi)使用。
大包裝塑料器皿或不能用上述方法消毒的試劑，可用電離輻射消毒。電離輻射消毒方式有兩種：一種是用2．5百萬拉德60Co產(chǎn)生的γ射線照射48～72小時(shí)；另一種是用大于5百萬電子伏特的高能電子束照射。前者穿透能力強(qiáng)，處理效果可靠，后者適于較小物品的滅菌。消毒時(shí)由輻照中心專業(yè)人員操作。
四.細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制與除菌
動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)常用液有平衡鹽溶液、培養(yǎng)基(天然和合成)及消化液等。配制這些常用液有嚴(yán)格的要求：
·使用高純化的三蒸水。
·按照用液的配方計(jì)算所需各成分的用量，然后準(zhǔn)確量取，并按規(guī)定順序溶于三蒸水中。
·保證各組分*溶解。
·進(jìn)行pH值測(cè)試和調(diào)整。
·消毒分裝小瓶，抽樣做無菌實(shí)驗(yàn)，保證用液無菌。
體外培養(yǎng)的細(xì)胞對(duì)水的質(zhì)量十分敏感，普通自來水含有大量離子和雜質(zhì)，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)不利，甚至?xí)鸺?xì)胞死亡。因此，培養(yǎng)細(xì)胞所用的水必須高度純化。目前純化水有離子交換水和蒸餾水，前者由于仍帶有非離子物質(zhì)和有機(jī)物質(zhì)，不適合組織培養(yǎng)使用。細(xì)胞組織培養(yǎng)必須使用三蒸水。經(jīng)金屬蒸餾器制備的蒸餾水又?；煊薪饘匐x子，故還需經(jīng)雙重純水蒸餾器(玻璃)蒸餾。本實(shí)驗(yàn)室組織培養(yǎng)用水制備過程是：自來水→離子交換水→玻璃雙重純水蒸餾器蒸餾兩次。新鮮三蒸水應(yīng)貯存于棕色磨口試劑瓶中，避免光對(duì)蒸餾水的作用。在使用過程中，應(yīng)盡量減少瓶口開放次數(shù)，減少污染機(jī)會(huì)。蒸餾水存放時(shí)間不要超過兩周，現(xiàn)制現(xiàn)用。
(2)平衡鹽溶液(balanced salt solution，BSS)的配制
BSS是在Rringer生理鹽水基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。它是人工合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)用液，又常用來洗滌組織細(xì)胞。其主要成分是無機(jī)鹽和葡萄糖。無機(jī)離子是細(xì)胞的重要成分，維持細(xì)胞滲透壓及其生存環(huán)境的穩(wěn)定；葡萄糖供給細(xì)胞生存所需的能量。BSS液中少量酚紅是作為溶液酸堿度變化的指示劑，溶液變酸時(shí)呈黃色，溶液弱堿性(pH7．2—7．4)時(shí)呈深紅色，pH值升高到7．6以上時(shí)為紫紅色。在碳酸鹽緩沖系統(tǒng)中，NaHCO3具有調(diào)節(jié)CO2濃度的作用。
Hanks液和Earle液是多數(shù)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)溶液，兩者的主要區(qū)別是緩沖能力不同。Hanks液的NaHCO3含量較低(0．35克/升)，其緩沖能力較弱，一般用空氣平衡，即利用空氣中的CO2使溶液pH值平衡。
Earle含有高濃度的NaHCO3(2．2克/升)，其緩沖能力較強(qiáng)，溶液pH值需在5％的CO2培養(yǎng)箱中才能達(dá)到平衡。
1.BSS液的配制方法(以Hanks液為例)
甲液：Na2HPO4·2H2O 0．06克
KH2PO4 0．06克
MgSO4·7H2O 0．20克
葡萄糖 1．00克
NaCl 8．00克
三蒸水 750毫升
乙液：CaCl2 0．14克
三蒸水 100毫升
①將乙液徐徐加入甲液中。②將0．35克NaHCO3溶解在37℃ 100毫升三蒸水中。③用數(shù)滴NaHCO3液溶解0．02克酚紅。④將②、③液移入①液中。⑤用三蒸水定容至1000毫升，充分混勻，4℃冰箱過夜。⑥濾過消毒，小瓶分裝，冷藏。
注意：酚紅對(duì)細(xì)胞有一定毒性，目前實(shí)驗(yàn)中的用量除0．02克外，還有0．01克和0．005克，也有BSS液中不加酚紅的。酚紅量不同，BSS顏色也不同。
2.配制BSS液的要求
①BSS液中各試劑規(guī)格為一級(jí)GR試劑或二級(jí)AR試劑。
②配制后液體呈桃紅色，pH 7．4左右，沒有混濁和沉淀。
③含鈣離子、鎂離子的物質(zhì)要單獨(dú)溶解。
④可配制10倍濃度的貯存液，濾過消毒，分裝，每瓶10毫升，冰箱保存。使用時(shí)每瓶加三蒸水至100毫升。
⑤鈣離子、鎂離子是細(xì)胞膜的重要組分，有使細(xì)胞凝聚的作用。因此，用于分離細(xì)胞的消化液宜用無鈣離子、鎂離子離子的D－Hanks液或PBS液配制。
天然培養(yǎng)基有血清、血漿、水解乳蛋白、膠原和組織提取液。
◇血清
血清質(zhì)量好壞是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、人AB血清、兔血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量，但來源困難，價(jià)格較貴。血清中含有：①多種蛋白質(zhì)(白蛋白、球蛋白、鐵蛋白、酶等)和核酸；②多種金屬離子(K＋、Na＋、Mg2＋、Cu2＋、Ca2＋等)；③激素；④促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)．、冷析球蛋白(cold insoluble globulin，CIG)等。血清為細(xì)胞提供激素；生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)移蛋白、基膜成分等，但血清成分個(gè)體差異大，常影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其來源又受限制。此外，血清也是污染細(xì)胞的一個(gè)途徑，它還是分離細(xì)胞代謝產(chǎn)物的一種障礙。
血清透明，呈淡黃色，不溶血或少溶血。血清經(jīng)56℃30分鐘滅活后，顏色較深。血清滅活后可能丟失某些成分，但滅活血清性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定，便于使用和保存。細(xì)胞培養(yǎng)用的血清必須保證無細(xì)菌、支原體、病毒污染。血清總蛋白量在35—45克/升，球蛋白量不高于20克/升。球蛋白含量高，示胎牛或孕牛感染，因此，球蛋白含量越低的血清，其質(zhì)量越好。
血清滅活處理步驟
①選用與血清瓶同規(guī)格的對(duì)照瓶一個(gè)。
②對(duì)照瓶?jī)?nèi)放入與血清等體積的水。
③溫度預(yù)試：對(duì)照瓶?jī)?nèi)插入2—3支經(jīng)挑選的溫度計(jì)(保證測(cè)試溫度的準(zhǔn)確性)，放入水浴箱中，接通電源，調(diào)節(jié)溫度控制鈕，使溫度計(jì)所示溫度保持在56℃。
④血清滅活：血清瓶與帶溫度計(jì)的對(duì)照瓶一齊放入水浴箱中，待溫度計(jì)所示溫度上升至56℃時(shí)，定時(shí)30分鐘。
⑤大瓶血清滅活后，進(jìn)行分裝。
⑥分裝后，抽樣做無菌試驗(yàn)，－20～－70℃保存。
使用血清注意事項(xiàng)
①實(shí)驗(yàn)者買到冰凍血清時(shí)，首先要觀察血清融化后的顏色和清亮度，若顏色偏紅，或色淺，或出現(xiàn)沉淀，表示血清質(zhì)差或變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)退貨。
②血清凍融后的上層無色透明，活力差，分裝前應(yīng)將其搖勻。
③血清反復(fù)凍融使用，其效價(jià)下降又容易污染。
④長(zhǎng)時(shí)間凍存的血清，一旦凍融后出現(xiàn)沉淀物(此物抑制細(xì)胞生長(zhǎng))，應(yīng)棄去。
⑤若有條件，先購買少量幾種批號(hào)血清，進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞克隆率檢查，從而篩選出質(zhì)量好的血清。
⑥為了使整個(gè)試驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定，以便前后比較，應(yīng)使用同一批號(hào)血清。
◇水解乳蛋白
水解乳蛋白為淡黃色粉末，雖易潮解結(jié)塊，但不影響使用。
不同批號(hào)和牌號(hào)質(zhì)量有差異。水解乳蛋白是乳白蛋白經(jīng)蛋白酶和肽酶水解后的產(chǎn)物，含有豐富的氨基酸。開始時(shí)它是專為猴腎細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)計(jì)的，而實(shí)際上它對(duì)許多細(xì)胞系(株)，如Hela細(xì)胞和原代細(xì)胞都是一種優(yōu)良培養(yǎng)基。使用時(shí)用Hanks液配制成0．5％溶液(酸性)，一般與合成培養(yǎng)基按1：1比例混合使用。
◇鼠尾膠原
膠原是細(xì)胞生長(zhǎng)的良好基質(zhì)，它能促進(jìn)組織和細(xì)胞的附著，改善生長(zhǎng)表面特性。膠原來源有大鼠尾腱、豚鼠、牛的和牛眼的水晶體等，實(shí)驗(yàn)室常用大鼠尾制膠原。鼠尾膠原為粘度較大的半透明液體，難以濾過除菌，應(yīng)無菌操作制備膠原。
鼠尾膠原的制備方法
①0．1％醋酸溶液，10磅10分鐘高壓滅菌備用。
②250克體重大白鼠尾一條，置75％酒精中浸泡1小時(shí)。
③鼠尾置平皿中切成1．5厘米左右的小段，剝?nèi)ッ?，抽出尾腱?/p>
④剪碎尾腱浸泡在150毫升醋酸液中，置于4℃冰箱內(nèi)，間斷振搖48小時(shí)。
⑤4000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘(在4℃條件)。
⑥上清液分裝小瓶，－20℃保存。
⑦殘?jiān)稍偌?0毫升醋酸液作用24小時(shí)后，離心收集保存。
鼠尾膠原使用方法
①將鼠尾膠原均勻涂于器皿的細(xì)胞生長(zhǎng)面，膠原量以不留液滴為度。
②培養(yǎng)瓶用沾有氨水的消毒棉球封口后置滅菌飯盒內(nèi)。
③室溫2小時(shí)，氨氣與鼠尾膠原作用，膠原凝固。
④用BSS液或基礎(chǔ)營養(yǎng)液洗滌膠原面后，再經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)液浸泡過夜，37℃干燥備用。
◇胚胎浸液
胚胎浸液能促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖。常用雞胚和牛胚浸液。將9—11天胎齡的雞胚磨碎，加等量緩沖液，離心收集上清液，即為雞胚浸液，于－20℃—－70℃保存。
(4)合成培養(yǎng)基
合成培養(yǎng)基是根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。目前已設(shè)計(jì)出許多種培養(yǎng)基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM、Ham'sF12等。這些培養(yǎng)基設(shè)計(jì)時(shí)各有其特定的目的，但實(shí)際上適用于多種細(xì)胞的培養(yǎng)。合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、 維生素、碳水化合物、無機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。
◇合成培養(yǎng)基的主要成分
氨基酸
氨基酸是組成蛋白質(zhì)的基本單位。不同種類細(xì)胞對(duì)氨基酸需求不同，體外培養(yǎng)的細(xì)胞必須依賴培養(yǎng)液供給12種必需L型氨基酸(精氨酸、組氨酸、半胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸和賴氨酸)。此外，用于培養(yǎng)上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等的培養(yǎng)液中還需補(bǔ)加谷氨酰胺。這是因?yàn)楣劝滨０烦俗鳛榈础⑻荚赐?，還能促進(jìn)各種氨基酸進(jìn)入細(xì)胞，它所含的氮既是核酸中嘌呤和嘧啶的來源，也是合成三、二和一磷酸腺苷的所需物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)又證實(shí)，谷氨酰胺在培養(yǎng)液中不穩(wěn)定，加有谷氨酰胺的培養(yǎng)液，半衰期在4℃時(shí)為3周，在36．5℃時(shí)為1周，因此使用兩周以上的培養(yǎng)液還需補(bǔ)加原量的谷氨酰胺。
碳水化合物
碳水化合物既是細(xì)胞的能量來源，也是合成某些氨基酸的原料，主要有葡萄糖、核糖、脫氧核糖、丙酮酸鈉和醋酸鈉等。
無機(jī)離子
無機(jī)離子是細(xì)胞的重要成分，它們?cè)谡{(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育和維持細(xì)胞生理功能等方面有重要作用。
它們還是某些維生素、激素、酶形成過程中*的原料。培養(yǎng)液中除平衡鹽溶液所含無機(jī)離子外，有的還含有如Fe2＋、Ze2＋、Cu2＋等離子。
維生素
維生素是維持細(xì)胞生長(zhǎng)的一種有機(jī)化合物，它分為脂溶性維生素和水溶性維生素兩大類。脂溶性維生素有維生素A、D、E、K等；水溶性維生素有維生素C和維生素B1、B2、B6、B12等。
其它成分
較為復(fù)雜的培養(yǎng)液中還包括核酸降解物如嘌呤、嘧啶、輔酶A以及氧化還原劑如抗壞血酸、谷胱甘肽等等。
◇合成培養(yǎng)基(液)的配制方法
人工合成培養(yǎng)基是細(xì)胞培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，稱為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，因它提供細(xì)胞生存所需的營養(yǎng)成分，還稱為細(xì)胞營養(yǎng)液。人工合成培養(yǎng)基有干粉型、1倍工作液型和10倍濃縮型。常用的干粉型培養(yǎng)基性質(zhì)穩(wěn)定，便于儲(chǔ)存和運(yùn)輸，使用方便。使用時(shí)按照說明書要求配制，要確保營養(yǎng)液所有組分*溶解，并在消毒和保存過程中不產(chǎn)生沉淀。
RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液
甲液：RPMI-1640 10．4克
Hepes 2．7～5．4克
三蒸水 700毫升
磁力攪拌至顆粒*溶解(3～4小時(shí)，橙黃色)
乙液：NaHCO3 2．0—2．2克
三蒸水 30毫升
37℃，30分鐘顆粒溶解
將甲、乙兩液混合，加水至終體積1000毫升，在4℃靜止2～3小時(shí)。濾過除菌，分裝，抽樣做無菌試驗(yàn)，－20℃凍存。
RPMI—1640血清細(xì)胞培養(yǎng)液
RPMI-1640基礎(chǔ)營養(yǎng)液 80毫升
滅活小牛血清 20毫升
青霉素、鏈霉素 各100單位/毫升
pH 7．1—7．2
◇配制合成培養(yǎng)基(液)注意事項(xiàng)
①用三天內(nèi)制備的玻璃三蒸水配制培養(yǎng)液。
②按二周用量配制為宜，配量過多，存放時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)造成培養(yǎng)基老化、變質(zhì)、產(chǎn)生沉淀。
③培養(yǎng)液中各成分是否*溶解的判斷方法：將培養(yǎng)液置室溫或4℃冰箱30分鐘后，觀察瓶底有無顆粒產(chǎn)生。
④根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，在培養(yǎng)液中加入適量37℃單獨(dú)溶解的NaHCO3溶液。正常體細(xì)胞培養(yǎng)液中NaCO3量為2．0—2．2克/升，腫瘤細(xì)胞為1．5—1．7克/升。
⑤干粉培養(yǎng)基不易溶于水，若用CO2加壓濾過或CO2沖擊助溶方法，因CO2用量不易掌握，常出現(xiàn)CO2用量過多使?fàn)I養(yǎng)液pH值明顯降低的情況，若再用NaHCO3調(diào)節(jié)pH值時(shí)，因NaHCO3的用量也難以掌握，常造成Na＋濃度過高，從而影響細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖。本實(shí)驗(yàn)室采用空氣CO2助溶法，即將甲液在磁場(chǎng)上攪拌3—4小時(shí)，當(dāng)甲液pH值下降到5．8左右時(shí)(橙黃色)，氨基酸和維生素基本溶解。在甲液內(nèi)再加入溶解有NaHCO3的乙液，兩液混和后，營養(yǎng)液pH值為7．0—7．1。抽濾后pH值上升0．1。此法操作簡(jiǎn)便，營養(yǎng)液pH值穩(wěn)定。
(5)血清細(xì)胞培養(yǎng)基
人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖，還需補(bǔ)充一定量的天然培養(yǎng)基，常用的是血清、谷氨酰胺等。另外，為防止污染，培養(yǎng)液中還要添加一定量的抗菌素。基礎(chǔ)培養(yǎng)基加血清、谷氨酰胺、抗菌素等物質(zhì)后，叫細(xì)胞培養(yǎng)基，也叫*培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)基按血清含量多少又分為兩種，即細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基和細(xì)胞維持培養(yǎng)基。
(6)無血清細(xì)胞培養(yǎng)基
血清中究竟哪些成分是細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的呢?幾十年來沒有明確答案。還有一些細(xì)胞在血清培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)。另外，由于血清成分復(fù)雜，常常給細(xì)胞培養(yǎng)后的研究工作，如細(xì)胞產(chǎn)物的提取、激素和藥物作用機(jī)理的研究帶來困難。1975年，Sato成功地用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)了垂體細(xì)胞株CH4，還有人用HamF12無血清細(xì)胞培養(yǎng)基成功地克隆了CHO細(xì)胞。近20多年來已報(bào)道了幾十種細(xì)胞系(株)在無血清細(xì)胞培養(yǎng)基中成功地生長(zhǎng)和增殖，這些細(xì)胞有內(nèi)分泌細(xì)胞、表皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和腎細(xì)胞等。無血清細(xì)胞培養(yǎng)基的使用保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可重復(fù)性和穩(wěn)定性，減少細(xì)胞污染，簡(jiǎn)化了提純和鑒定 McAb、淋巴因子、干擾素等細(xì)胞產(chǎn)物的程序，降低疫苗反應(yīng)。
無血清培養(yǎng)基一般由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和替代血清的補(bǔ)充成分組成。
◇基礎(chǔ)培養(yǎng)基
必須根據(jù)不同的培養(yǎng)細(xì)胞選用合適的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基有MEM、NT、M199、F12、DMEM、RPMI—1640、IMDM、DMEM：F12＝1：1、RPMI—1640：DMEM：F12=2：1：1等，其中DMEM和F12混合培養(yǎng)液為多種細(xì)胞使用，根據(jù)不同細(xì)胞的要求，每升中補(bǔ)加Hepes 15毫摩爾，NaHCO31．2—2．4克。
◇無血清培養(yǎng)基的補(bǔ)充成分
補(bǔ)充成分即代替血清的各種因子的總稱。多數(shù)無血清培養(yǎng)液必須補(bǔ)加3～8種因子，任何單一因子不能取代血清，至少需兩種。已知有100多種此類因子，其中有些是必需補(bǔ)充因子，如胰島素、(Na2SeO3)和轉(zhuǎn)鐵蛋白，其它多數(shù)為輔助作用因子。補(bǔ)充成分按功能將其分成四類。
激素和生長(zhǎng)因子
很多細(xì)胞用無血清培養(yǎng)時(shí)需加入激素，如胰島素(Ins)、生長(zhǎng)激素、胰高血糖素等。此外，甾體激素如孕酮、、雌二醇等也是無血清細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)常用的補(bǔ)充因子。幾乎所有的細(xì)胞系都需要Ins，它是一種多肽，能與細(xì)胞亡的Ins受體結(jié)合形成復(fù)合物，調(diào)節(jié)和控制細(xì)胞內(nèi)多種代謝途徑，加強(qiáng)糖原、蛋白質(zhì)、甘油三酯和DNA的合成。其原因可能是Ins中混雜某些刺激細(xì)胞生長(zhǎng)的物質(zhì)和重要的微量元素，但也有細(xì)胞不加胰島素也能生長(zhǎng)。前列腺素E1和E2能刺激細(xì)胞生長(zhǎng)，增加細(xì)胞環(huán)磷腺苷的水平。有些激素能調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)某種生化反應(yīng)，如腐胺能促進(jìn)細(xì)胞(B104)快速分裂，是因?yàn)榧に啬茉黾蛹?xì)胞內(nèi)腐胺的合成或促進(jìn)腐胺轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)。生長(zhǎng)因子是維持細(xì)胞生存和增殖所必需的物質(zhì)，依照化學(xué)性質(zhì)可分為多肽生長(zhǎng)因子和甾體生長(zhǎng)因子。多肽生長(zhǎng)因子相對(duì)分子質(zhì)量在10000左右，目前已鑒定的有數(shù)十種，其中半數(shù)以上是近幾年發(fā)現(xiàn)和鑒定的。脊椎動(dòng)物至少有30種細(xì)胞類型(神經(jīng)、肝、腎、支氣管等)，每種細(xì)胞至少有2—3種生長(zhǎng)因子對(duì)其正常生存和增殖起著調(diào)節(jié)作用，因此估計(jì)機(jī)體中約有100多種生長(zhǎng)因子。按結(jié)構(gòu)和功能可分為表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)等。生長(zhǎng)因子是有效的促有絲分裂原，能縮短細(xì)胞倍增時(shí)間。
結(jié)合蛋白
結(jié)合蛋白有兩種，一種是轉(zhuǎn)鐵蛋白(TF)，它能增強(qiáng)細(xì)胞攝取和利用培養(yǎng)液中鐵的能力，還可結(jié)合毒性金屬離子，不同細(xì)胞需要量不同。有人認(rèn)為TF中混雜有激素，也足以刺激細(xì)胞生長(zhǎng)。白蛋白是另一種結(jié)合蛋白，它與脂類、金屬離子、激素等結(jié)合后，具有刺激細(xì)胞增殖作用。
貼壁因子
絕大多數(shù)真核細(xì)胞在體外生長(zhǎng)時(shí)需要固著于適當(dāng)?shù)幕?，幫助?xì)胞固著貼附的物質(zhì)叫貼壁因子或胞外基質(zhì)。體外培養(yǎng)細(xì)胞常于粘著斑(adhension plaque)或其近旁發(fā)現(xiàn)纖維粘連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)，此處質(zhì)膜下正是紐帶蛋白(vinculin)及α－輔助肌動(dòng)蛋白(α-actin)存在部位。肌動(dòng)蛋白絲借助這兩種蛋白質(zhì)附著于質(zhì)膜的內(nèi)表面。FN又與非膠原糖蛋白相連。膜上FN受體將細(xì)胞外基質(zhì)FN與細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白絲相連。這樣，胞外基質(zhì)、細(xì)胞膜受體及細(xì)胞內(nèi)某些分子直接或間接作用，共同形成細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的統(tǒng)一體，成為控制細(xì)胞形態(tài)、功能、生長(zhǎng)、分化以及某些其它性質(zhì)(如影響質(zhì)膜中蛋白質(zhì)的組織等)的重要因素之一。如體外培養(yǎng)的神經(jīng)元存活及分化主要決定于所提供的細(xì)胞外基質(zhì)；肌細(xì)胞分化，肝細(xì)胞和乳腺細(xì)胞的形態(tài)、代謝，腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程，都與細(xì)胞外基質(zhì)有關(guān)。
常用貼壁因子儲(chǔ)存液的配制方法：
纖維連結(jié)素 以1摩爾/升的尿素PBS液配制成1毫克/毫升的母液，－20℃保存。
多聚賴氨酸(poly-D-lysine)相對(duì)分子質(zhì)量300000，貯存濃度為1毫克/毫升(用D-Hanks液或PBS液配制)。4℃冰箱保存，不能凍存。
膠原(collagens) 貯存濃度為1—3毫克/毫升，溶解在PBS液或0．1摩爾/升的鹽酸或0．1摩爾/升的醋酸液中。
貼壁因子使用方法：
①選擇適宜的貼壁因子。
②將貼壁因子貯存液用三蒸水或PBS液或D-Hanks液稀釋成0．1毫克/毫升的工作液。
③濾過除菌的工作液按50微升/平方厘米涂布培養(yǎng)器皿的細(xì)胞生長(zhǎng)面。
④室溫靜置5分鐘(膠原基質(zhì)延長(zhǎng)24小時(shí))。
⑤除去多余溶液。
⑥涂布面用滅菌三蒸水洗滌后，再經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基浸泡過渡，備用。
微量元素
微量元素對(duì)細(xì)胞長(zhǎng)期傳代的作用于1981年由Murakam首先報(bào)道。硒元素不僅具有抗過氧化物酶對(duì)細(xì)胞的毒副作用，還可增強(qiáng)其它因子的作用，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。1983年，Clereand用一組復(fù)雜的微量元素，使8株雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖。這表明無血清培養(yǎng)液中補(bǔ)加的激素和生長(zhǎng)因子的作用，可能是由于混雜一些重要的微量元素所致。
此外，實(shí)驗(yàn)證實(shí)長(zhǎng)期使用無血清細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，會(huì)改變細(xì)胞的某些特性。是因?yàn)樵诩?xì)胞傳代時(shí)，常需借助酶的作用，無血清培養(yǎng)基缺乏對(duì)細(xì)胞保護(hù)的成分，殘余的酶會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損傷，因此無血清培養(yǎng)基內(nèi)必須添加酶抑制劑以中止殘余酶的作用。目前常用的是大豆胰酶抑制劑(soybean trypsin inhibitor)，使用濃度為0．1％－0．5％，濾過除菌后，將其加在DMEM／F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液內(nèi)。
目前無血清細(xì)胞培養(yǎng)基的應(yīng)用仍處在探索階段，尚無固定配方。應(yīng)根據(jù)不同的細(xì)胞和不同的培養(yǎng)要求選擇合適的補(bǔ)充因子。
◇無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞系(株)的特點(diǎn)
①無血清培養(yǎng)液中能促進(jìn)細(xì)胞系生長(zhǎng)的補(bǔ)加物都是*的。適用于某種細(xì)胞株的培養(yǎng)液，可能不適合另一種細(xì)胞株的生長(zhǎng)。
②同源組織的不同細(xì)胞株，所需激素也不同。如人乳腺癌MCF-7和ZR-75-1兩株細(xì)胞所需的轉(zhuǎn)鐵蛋白(TF)量前者大25倍，Ins的量后者大30倍。
③同一種細(xì)胞用的基礎(chǔ)營養(yǎng)液不同，所需激素也不同。如HeLa在F12液需加Ins、TF、EGF、FGF和氫化考的松，而在HMCDB105液中只需加TF和EGF兩種成分就能生長(zhǎng)。
④不同來源的細(xì)胞株需要不同的激素和生長(zhǎng)因子。如MCF－7細(xì)胞需要EGF，HeLa細(xì)胞需要?dú)浠嫉乃珊虵GF。
◇胰蛋白酶液
胰蛋白酶(trypsin)是一種黃白色粉末，來自?；蜇i的胰臟。當(dāng)其水解蛋白質(zhì)時(shí)，作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽腱，除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細(xì)胞骨架，從而使細(xì)胞分離。胰 蛋白酶的活力是用解離酪蛋白的能力表示的，常用的有1：125和1：250兩種，即1份胰蛋白酶能解離125份或250份酪蛋白。胰蛋白酶適用于消化細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織。胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞的分離作用與細(xì)胞的類型和細(xì)胞的性質(zhì)有密切關(guān)系。不同的細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶液的濃度、作用溫度和作用時(shí)間等要求也不一樣。一般來說，濃度越大、溫度越高、作用時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞的分離能力也越大，但超過一定限度就會(huì)損傷細(xì)胞。常用的胰蛋白酶液的濃度是0．25％和0．125％，作用溫度是37℃或室溫，pH7．4左右。許多學(xué)者認(rèn)為Ca2＋、Mg2＋和血清的存在，都會(huì)降低其活力，所以要用無Ca2＋、Mg2＋的D-Hanks液配制酶液。細(xì)胞一旦分散后，可用血清培養(yǎng)液終止其對(duì)細(xì)胞的消化作用。0．25％胰蛋白酶液的配制方法如下。
過濾消毒法
①按實(shí)驗(yàn)需要稱取酶粉，用少量D-Hanks液將胰蛋白酶粉調(diào)成糊狀。
②加適量D-Hanks液(橙紅色)，磁力攪拌3～5天即可溶解(室溫和4℃間斷進(jìn)行，室溫高于30℃要減少酶液在室溫中的攪拌時(shí)間)。
③溶解后的酶液(深紅色)濾過除菌，分裝，－20℃凍存。
高熱消毒法
利用胰蛋白酶在酸性條件下有較好的熱穩(wěn)定性，對(duì)其進(jìn)行高熱消毒。
①按實(shí)驗(yàn)需要稱取酶粉溶于1毫摩爾/升pH3．0的HCl中。
②酶液和2倍D-Hanks液同時(shí)在0．1兆帕，120℃條件下滅菌20分鐘。
③兩液冷卻至室溫時(shí)，等量混勻。酶液濃度高時(shí)，消毒后有少量的沉淀，去除沉淀后，兩液等體積混勻。然后用10摩爾/升的NaOH調(diào)消化液pH值至7．2(橙紅色或深紅色)。
④經(jīng)計(jì)算，消毒后酶濃度下降50％。如消毒前酶濃度為0．1％－0．5％，消毒后為0．05％～0．25％。高熱消毒法比過濾消毒法更加簡(jiǎn)便、安全、可靠。
◇EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)溶液
EDTA·2Na是一種化學(xué)螯合劑(商品名為Vorson)，它對(duì)細(xì)胞有一定的解離作用，并且毒性小，使用方便。常用D-Hanks液配—成0．02％EDTA工作液，高壓滅菌后使用。EDTA的作用原理是：一些組織，尤其是上皮組織，在生長(zhǎng)過程中需Ca2＋和Mg2＋維持組織的完整性，EDTA從細(xì)胞生存環(huán)境中奪取這些離子，形成螯合物，從而使細(xì)胞分離，因此，胰蛋白酶和EDTA混合使用可提高消化效率。EDTA只用于消化傳代細(xì)胞。EDTA作用不受血清抑制，故消化后需*去除，否則會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)。
◇膠原蛋白酶液
膠原酶(collagenase)的主要作用是使細(xì)胞間質(zhì)的脯氨酸多肽水解，從而使細(xì)胞離散。膠原酶消化的不是細(xì)胞表面，而是細(xì)胞間質(zhì)。該酶不同批號(hào)或同一批號(hào)不同生產(chǎn)日期都有質(zhì)量差異。目前國內(nèi)多數(shù)實(shí)驗(yàn)室使用的膠原酶大多是從芽孢桿菌中提取出來的。溶組織梭狀芽孢桿菌膠原酶中含羧菌肽酶(0．57—0．59單位/毫克)具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，能破壞細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)和多肽，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性改變。因此，用它消化組織時(shí)，應(yīng)采取多步收集法(20～30分鐘/次)，這樣才可獲得完整細(xì)胞膜和大活細(xì)胞收率。膠原酶在Ca2＋和Mg2＋存在下仍有活性，血清亦不能抑制其活性，故消化后應(yīng)充分漂洗。不同來源的膠原酶對(duì)于不同類型膠原纖維的水解作用強(qiáng)弱不等。
膠原酶液配制方法：用基礎(chǔ)營養(yǎng)液或Hanks液配制，常用劑量分別為200單位/毫升或0．1—0．3毫克/毫升。膠原酶粉用Hanks或基礎(chǔ)營養(yǎng)液調(diào)成糊狀，液體加至定量后，置磁場(chǎng)攪拌至基本溶解，濾過除菌分裝，－20℃凍存。
此外，鏈霉蛋白酶、胃膠原酶、透明質(zhì)酸酶、粘蛋白酶、蝸牛酶和分散酶(dispase)都可作為消化液，但價(jià)格昂貴，保存困難，故較少使用，只在獲取某類特殊細(xì)胞情況下使用。也有實(shí)驗(yàn)室將膠原酶和胰蛋白酶混合使用分離細(xì)胞，效果也不錯(cuò)。其原因是細(xì)胞間質(zhì)的膠原結(jié)構(gòu)對(duì)一般的蛋白水解酶有抗性，聯(lián)用時(shí)，膠原酶首先水解膠原，繼而胰蛋白酶協(xié)同解離細(xì)胞。
◇NaHCO3溶液
常用的濃度有7．4％、5．6％、3．7％三種，配制時(shí)用37℃三蒸水溶解后通過濾膜過濾除菌，分裝于安瓿中，4℃冰箱保存，每支一次用完。使用時(shí)，NaHCO3液要逐滴加入，并不時(shí)攪動(dòng)培養(yǎng)液，以防pH值過高。
◇10％醋酸液
高壓滅菌，分裝，4℃冰箱保存。使用方法和要求同NaHCO3液。
◇Hepes液
Hepes[4－(2－h(huán)ydroxyethyl)，－1－peperazineethane sul－phonic acid]是一種氫離子緩沖劑，它可以長(zhǎng)時(shí)間保持較強(qiáng)的緩沖作用，維持恒定的pH值。20毫摩爾/升的濃度對(duì)細(xì)胞無毒性，多數(shù)細(xì)胞都能適用。
L-谷氨酰胺2．9222克(M＝146．15)，加適量50℃三蒸水溶解，定容至100毫升，濾過除菌，1毫升/安瓿，－20℃保存。使用時(shí)每100毫升培養(yǎng)基中加1毫升谷氨酰胺。
在組織培養(yǎng)工作中，培養(yǎng)液內(nèi)需加適量抗菌素，以抑制可能存在的細(xì)菌和霉菌的生長(zhǎng)，而不影響細(xì)胞的生長(zhǎng)。通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。在特殊情況下，選擇哪一種抗菌素、劑量多少、何時(shí)加入等等，與污染源、抗菌素的抗菌范圍、抗菌素的穩(wěn)定性等有密切關(guān)系。
◇青霉素、鏈霉素(雙抗)液
用10毫升Hanks液或三蒸水溶解100萬微克的硫酸鏈霉素，用8毫升硫酸鏈霉素液溶解80萬單位青霉素粉，即成每毫升青霉素、鏈霉素各10萬單位的母液。使用時(shí)，在100毫升培養(yǎng)基內(nèi)加母液0．1毫升，則培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、鏈霉素終使用濃度為每毫升100單位。
◇卡那霉素液
將1瓶卡那霉素(50000微克/瓶)溶于5毫升Hanks液中，即成10000微克/毫升的母液。使用時(shí)每100毫升培養(yǎng)基內(nèi)加0．5毫升母液，即每毫升培養(yǎng)液內(nèi)終使用濃度為50微克/毫升。
◇制霉菌素液
因其不能溶于水，故只能制成5000單位/毫升的懸液，使用時(shí)每100毫升培養(yǎng)基內(nèi)加0．5毫升懸液，即每毫升營養(yǎng)液內(nèi)含25單位的制霉菌素。
◇細(xì)胞用液的分裝方法
①使用正壓濾器時(shí)，采用邊過濾邊分裝的方法。瓶口的液體用于酒精棉球擦去，火焰消毒，加塞包裝。
②使用負(fù)壓濾器時(shí)，借助消毒吸管將液體移入分裝瓶?jī)?nèi)，其它操作同上。
◇細(xì)胞用液的分裝要求
①行嚴(yán)格無菌操作。盡量減少試劑在空氣中的暴露時(shí)間。
②根據(jù)配量準(zhǔn)備分裝瓶和瓶塞，分裝瓶規(guī)格、數(shù)量應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要準(zhǔn)備。避免因包裝瓶過大、貯液時(shí)間過長(zhǎng)或反復(fù)凍融使用造成營養(yǎng)成分丟失和微生物污染。按一次用量或一周內(nèi)用量挑選小包裝瓶。融化后的液體置4℃保存。
③分裝前做好分裝量標(biāo)記，分裝瓶?jī)?nèi)液體量要小于瓶容積的2/3。
④做好分裝瓶標(biāo)記，包括試劑名稱、濃度、配制日期、組號(hào)。
