信使核糖核酸（mRNA）療法在疫苗研發(fā)、蛋白替代治療、基因編輯、免疫治療 及組織再生領(lǐng)域幾乎擁有無(wú)限臨床應(yīng)用潛力。mRNA 疫苗成功抑制病毒肺炎全球大流行，印證了這類療法的臨床價(jià)值?；谠撏黄?，我們預(yù)期面向其他適應(yīng)癥的 mRNA 療法臨床轉(zhuǎn)化進(jìn)程將迎來(lái)快速增長(zhǎng)。但想要充分釋放 mRNA 藥物的治療潛力，該領(lǐng)域亟需開發(fā)能夠靶向病變細(xì)胞與組織的遞送載體系統(tǒng)。

研發(fā)遞送載體十分必要：裸露 mRNA 的藥代動(dòng)力學(xué)特性較差，在抵達(dá)靶細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)（蛋白質(zhì)翻譯發(fā)生的場(chǎng)所）前就會(huì)被核酸酶快速降解并清除。高效遞送系統(tǒng)需要實(shí)現(xiàn)三大功能：保護(hù) mRNA 免受體內(nèi)核酸酶降解、促使靶細(xì)胞攝取載體、介導(dǎo) mRNA 從胞內(nèi)體釋放至細(xì)胞質(zhì)。脂質(zhì)納米顆粒（LNP）是已在人體臨床試驗(yàn)中得到驗(yàn)證的 RNA 遞送載體 ，但絕大多數(shù) LNP 僅能將 mRNA 遞送至免疫細(xì)胞與肝細(xì)胞，難以靶向其他細(xì)胞。肌肉注射疫苗可將 mRNA 有效遞送至免疫細(xì)胞；而蛋白替代療法、免疫治療通常需要靜脈給藥。例如，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)的小干擾 RNA（siRNA）脂質(zhì)納米顆粒藥物帕替西蘭，經(jīng)靜脈給藥靶向肝細(xì)胞，用于治療遺傳性轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白淀粉樣變性。此外，英特利亞治療公司與再生元制藥近期完成的一項(xiàng)臨床試驗(yàn)取得陽(yáng)性結(jié)果，該研究利用 RNA-LNP 介導(dǎo)基因編輯技術(shù)治療淀粉樣變性。以上成果均證實(shí) RNA-LNP 具備疾病治療潛力。但迄今為止，實(shí)現(xiàn) RNA 全身遞送至肝臟、脾臟以外臟器的相關(guān)研究進(jìn)展十分有限。

若要實(shí)現(xiàn)難轉(zhuǎn)染細(xì)胞的 mRNA 遞送，可對(duì) mRNA-LNP 的多項(xiàng)設(shè)計(jì)參數(shù)與給藥方式進(jìn)行優(yōu)化調(diào)整，包括脂質(zhì)組分、mRNA 序列 、給藥途徑 以及引入主動(dòng)靶向配體。脂質(zhì)納米顆粒一般包含四類脂質(zhì)原料：可電離脂質(zhì)、兩親性磷脂（即輔助脂質(zhì)）、膽固醇與聚乙二醇（PEG）修飾脂質(zhì)。可電離脂質(zhì)是 LNP 研發(fā)的核心，胞內(nèi)體內(nèi) pH 值下降時(shí)，該脂質(zhì)發(fā)生質(zhì)子化，進(jìn)而促進(jìn) mRNA 逃離胞內(nèi)體。然而，研究人員篩選了海量脂質(zhì)文庫(kù)，僅找到極少數(shù)材料能夠?qū)崿F(xiàn)肝臟、脾臟外組織的 mRNA 遞送。更換給藥途徑可突破該局限，本實(shí)驗(yàn)室 與其他研究團(tuán)隊(duì) 均已證實(shí)，更換給藥方式可將 mRNA 遞送至心臟 、大腦、肺部 等臟器。向體系中添加帶電兩親性磷脂同樣能夠?qū)崿F(xiàn)肝外 mRNA 遞送，該改造可使目標(biāo)蛋白的表達(dá)位點(diǎn)從肝臟轉(zhuǎn)移至脾臟或肺部。

盡管上述技術(shù)取得諸多進(jìn)展，但利用 mRNA-LNP 靶向胰腺細(xì)胞遞送 mRNA 依舊存在巨大挑戰(zhàn)。該遞送技術(shù)一旦落地，可為胰腺癌、糖尿病等無(wú)法治療胰腺疾病提供挽救生命的治療方案。胰腺兼具內(nèi)分泌與外分泌雙重功能：胰島細(xì)胞負(fù)責(zé)維持機(jī)體葡萄糖穩(wěn)態(tài)，腺泡細(xì)胞則向十二指腸分泌消化酶。已有研究通過(guò)病毒遞送載體證實(shí)了胰腺 mRNA 遞送的臨床前景。例如，吉特斯團(tuán)隊(duì)研究表明，借助病毒載體向胰腺遞送基因，可再生分泌胰島素的 β 細(xì)胞，用于治療自身免疫性糖尿病。病毒載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞效率雖高，但存在基因組整合風(fēng)險(xiǎn)，且免疫原性強(qiáng)，難以實(shí)現(xiàn)多次給藥。除此之外，若利用病毒載體治療胰腺疾病，需要借助內(nèi)鏡逆行胰膽管造影術(shù)通過(guò)胰管注射給藥，該操作屬于有創(chuàng)手術(shù)，還存在誘發(fā)胰腺炎的風(fēng)險(xiǎn)。

為替代病毒基因治療方案，我們著手研發(fā) mRNA-LNP，以期建立非病毒胰腺基因遞送技術(shù)，同時(shí)降低給藥操作的侵入性。為此我們選用腹腔注射給藥：該方式可選擇性將藥物遞送至腹腔病灶，適用于卵巢腫瘤、胰腺腫瘤等腹腔腫瘤治療。與靜脈給藥相比，腹腔給藥能夠降低全身毒副作用、提升藥物生物利用度；同時(shí)納米顆粒在腹腔內(nèi)滯留時(shí)間更長(zhǎng)，可延長(zhǎng)與腹腔臟器靶組織的接觸時(shí)長(zhǎng)。

本文報(bào)道一種可強(qiáng)效、特異性向胰腺遞送 mRNA 的脂質(zhì)納米顆粒配方。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，即便采用化學(xué)結(jié)構(gòu)不同的各類可電離脂質(zhì)制備 LNP，腹腔注射 mRNA-LNP 后均可在胰腺內(nèi)產(chǎn)生高水平目標(biāo)蛋白。該遞送方案主要誘導(dǎo)胰腺胰島內(nèi)負(fù)責(zé)分泌胰島素的 β 細(xì)胞表達(dá)外源蛋白。我們進(jìn)一步證實(shí)，腹腔巨噬細(xì)胞分泌的胞外囊泡（EV）可輔助完成 mRNA 遞送，且該遞送體系不會(huì)引發(fā)全身毒性。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，mRNA-LNP 是一種可靠的非病毒載體，能夠在傳統(tǒng)手段難以轉(zhuǎn)染的胰腺細(xì)胞中誘導(dǎo)外源蛋白表達(dá)。

腹腔注射（IP）相對(duì)于靜脈注射（IV）提高胰腺的表達(dá)水平：

本研究采用三種不同可電離類脂質(zhì)分別制備搭載熒光素酶 mRNA（mLuc）的脂質(zhì)納米顆粒（LNP），三類類脂質(zhì)分別為 (A) 306Oi10、(B) 200Oi10、(C) 514O6,10；脂質(zhì)摩爾配比統(tǒng)一為：35% 類脂質(zhì)、16% 二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE）、46.5% 膽固醇、2.5% 聚乙二醇修飾脂質(zhì)。將各組制劑給藥至 C57BL/6 小鼠，mRNA 給藥劑量 0.5 毫克每千克體重，每組 3 只小鼠。

給藥 3 小時(shí)后，給小鼠注射 D - 熒光素底物，隨后處死并解剖分離臟器，借助活體成像系統(tǒng)（IVIS）開展離體熒光發(fā)光成像。

左側(cè)圖版為各主要臟器具有代表性的活體成像圖；中間圖版對(duì) mLuc 熒光素酶表達(dá)水平進(jìn)行定量統(tǒng)計(jì)；右側(cè)圖版展示單個(gè)臟器的蛋白表達(dá)量占全部臟器總表達(dá)量的百分比。

相較于靜脈注射（IV）給藥途徑，腹腔注射（IP）能夠提升全部配方 LNP 的 mRNA 遞送效率。

腹腔注射后，腹腔巨噬細(xì)胞參與介導(dǎo) mRNA 向胰腺的遞送過(guò)程：

(A) 向小鼠腹腔注射搭載 Cy5 標(biāo)記熒光素酶 mRNA（Cy5-mLuc）的脂質(zhì)納米顆粒，給藥劑量 0.5 mg/kg。注射完畢后立刻處死，收集腹腔灌洗液用于流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。結(jié)果顯示 Cy5-mLuc 可結(jié)合于 B 細(xì)胞、T 細(xì)胞以及 CD11b?/F4/80?巨噬細(xì)胞。

(B) B 細(xì)胞、T 細(xì)胞與 CD11b?/F4/80?巨噬細(xì)胞中 Cy5-mLuc 的平均熒光強(qiáng)度（MFI）統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

(C) 淋巴細(xì)胞遷移并不會(huì)促進(jìn) mRNA 向胰腺遞送。本實(shí)驗(yàn)選用野生型（wt）NOD 小鼠與缺失成熟淋巴細(xì)胞的 NOD/SCID 小鼠，腹腔注射攜帶熒光素酶 mRNA（mLuc）或 Cy5 標(biāo)記 mRNA 的脂質(zhì)納米顆粒（給藥劑量 0.5 mg/kg）；3 小時(shí)后處死小鼠，開展離體活體成像系統(tǒng)（IVIS）發(fā)光檢測(cè)。淋巴細(xì)胞缺失與否，不會(huì)改變胰腺內(nèi)熒光素酶表達(dá)水平，也不會(huì)改變 Cy5 熒光信號(hào)在胰腺的分布情況。

(D) 設(shè)置對(duì)照組小鼠腹腔注射磷酸鹽緩沖液（PBS），實(shí)驗(yàn)組小鼠腹腔注射氯膦酸二鈉脂質(zhì)體以清除體內(nèi)巨噬細(xì)胞。48 小時(shí)后，全部小鼠腹腔注射 mLuc 脂質(zhì)納米顆粒，利用活體成像系統(tǒng)定量檢測(cè)胰腺內(nèi)生物發(fā)光強(qiáng)度。巨噬細(xì)胞清除組小鼠的胰腺轉(zhuǎn)染效率顯著下降。

論文信息：

論文題目：Ionizable lipid nanoparticles deliver mRNA to pancreatic β cells via macrophage-mediated gene transfer

期刊名稱：Science Advances

時(shí)間期卷：Vol 9, Issue4(2023)

在線時(shí)間：2023年1月27日

DOI: 10.1126/sciadv.ade1444

產(chǎn)品信息：

貨號(hào)：CP-005-005

規(guī)格：5ml+5ml

品牌：Liposoma

產(chǎn)地：荷蘭

名稱：Clodronate Liposomes&Control Liposomes

辦事處：靶點(diǎn)科技

Clodronate Liposomes氯膦酸鹽脂質(zhì)體腹腔注射清除巨噬細(xì)胞后，特異性靶向胰腺遞送 mRNA脂質(zhì)納米顆粒遞送。荷蘭Liposoma巨噬細(xì)胞清除劑ClodronateLiposomes見刊于Science Advances：可電離脂質(zhì)納米顆粒通過(guò)巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的基因遞送途徑，將信使核糖核酸遞送至胰腺 β 細(xì)胞。

Liposoma巨噬細(xì)胞清除劑Clodronate Liposomes氯膦酸二鈉脂質(zhì)體清除巨噬細(xì)胞的材料和方法：

Macrophage depletion

All animal experiments were conducted using institutionally approved protocols (Institutional Animal Care and Use Committee). C57BL/6 mice (female unless otherwise indicated) were obtained from Charles River Laboratories, Wilmington, MA. STZ mice (males) and NOD and NOD/SCID mice (females) were obtained from the Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). STZ mice exhibited hyperglycemia (blood glucose > 250 mg/dl) upon arrival. In experiments involving clodronate liposomes, clodronate liposomes and control liposomes were purchased from Liposoma (Amsterdam, The Netherlands). Mice received intraperitoneal injections of 200 μl of clodronate or control liposomes 48 hours before LNP treatment. For fluorescence and luminescence studies, dissected organs were imaged using an IVIS (Perkin Elmer). In experiments using mRNA encoding luciferase, mice received an intraperitoneal injection of 130 μl of d-luciferin (30 mg/ml) 15 min before imaging. Blood samples were drawn via submandibular bleed and collected in Microtainer Serum Separator tubes (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ).

巨噬細(xì)胞清除材料和方法文獻(xiàn)截圖：