一、實驗前準備選用 6–8 周齡 SPF 級 SD 大鼠，術(shù)前 75% 乙醇消毒。器械高溫高壓滅菌，配制含雙抗的 D-Hank’s 液、膠原酶 Ⅱ 與彈性蛋白酶混合消化液，培養(yǎng)基采用 DMEM/F12 添加 15% 胎牛血清、雙抗及平滑肌細胞生長添加劑，全程在超凈臺內(nèi)操作。

 

二、組織分離與預處理麻醉大鼠后開胸取心肺組織，置于預冷 D-Hank’s 液中，在體視顯微鏡下剝離肺動脈主干及分支，仔細剔除外膜脂肪與結(jié)締組織，輕柔刮除內(nèi)膜內(nèi)皮細胞，僅保留中膜層，避免雜細胞污染。將純化血管剪為 1mm³ 小塊，用 D-Hank’s 液漂洗 2–3 次，去除血液與組織碎屑。

 

三、酶消化與細胞獲取將組織塊轉(zhuǎn)入混合消化液，37℃恒溫消化 60–90 分鐘，期間每 15 分鐘輕柔吹打一次。消化結(jié)束后加入含血清培養(yǎng)基終止反應，通過 70μm 細胞篩過濾去除未消化組織，濾液離心棄上清，用完全培養(yǎng)基重懸沉淀，獲得原代細胞懸液。

 

四、接種與差速貼壁純化細胞懸液接種于培養(yǎng)瓶，37℃、5% CO?培養(yǎng)箱靜置。利用平滑肌細胞與成纖維細胞貼壁速度差異，采用差速貼壁法純化：接種后 90 分鐘輕輕吸出未貼壁細胞，更換新鮮培養(yǎng)基，去除快速貼壁的成纖維細胞，提高 RPASMCs 純度。

 

五、培養(yǎng)與傳代質(zhì)控細胞貼壁伸展后呈梭形，匯合時形成典型峰谷排列。待融合達 80%–90% 時傳代，用 0.25% 胰蛋白酶 - EDTA 消化，傳代比例 1:2，建議使用 P3–P6 代細胞用于實驗，避免老化表型改變。每日觀察形態(tài)，定期用 α- 平滑肌肌動蛋白（α-SMA）免疫熒光鑒定，陽性率需＞90%。

 

六、關(guān)鍵注意事項全程嚴控無菌，防止真菌與細菌污染；消化時間需精準把控，避免過度消化損傷細胞；培養(yǎng)基 2–3 天更換一次，維持營養(yǎng)與 pH 穩(wěn)定。規(guī)范操作可獲得高活性、高純度 RPASMCs，為肺血管重構(gòu)與藥物篩選研究提供可靠模型。