3. 目的蛋白定位：

（1）細胞質(zhì)蛋白：β-Actin、β-Tubulin、α-Tubulin、GAPDH、Vinculin、Cyclophilin B等；

（2）細胞核蛋白：PCNA、Lamin A、Lamin B、Histone H3、K70、K80、Erk2、TATA binding protein (TBP)、c-Jun、c-Fos、YY1、HDAC1等；

（3）細胞膜蛋白：Na⁺/K⁺ ATPase等；

（4）細胞質(zhì)膜蛋白：ATP1A1 (Sodium Potassium ATPase)等；

（5）線粒體蛋白：VDAC1、COXIV等；

（6）全血/血漿/血清：Transferrin、Albumin等。

4. 表達水平：

在特定實驗條件下（如特殊的實驗處理或不同的發(fā)育階段），內(nèi)參蛋白的表達水平相對于總蛋白需要保持恒定且高表達。常用的內(nèi)參是由管家基因表達的，是細胞發(fā)育和維持細胞活力所必須的蛋白。例如，細胞核的內(nèi)參蛋白PCNA，在DNA S期表達，因此對于非增殖細胞不推薦使用。

5. 豐度相似性：

實驗樣本中內(nèi)參蛋白的表達豐度應(yīng)與目的蛋白的豐度有相似性，實驗方案和檢測方法可以揭示內(nèi)參蛋白和目標蛋白水平的變化，而不會出現(xiàn)信號飽和。如果內(nèi)參蛋白的表達水平遠遠高于目的蛋白，必須對內(nèi)參蛋白進行梯度稀釋以確定內(nèi)參蛋白的檢測范圍。

6. 表達因素：

（1）選擇蛋白表達不受實驗變量影響的內(nèi)參，有研究表明，管家蛋白的表達有時并不恒定，會因?qū)嶒灄l件的改變而改變。因此設(shè)計實驗方案時應(yīng)該考慮實際的實驗因素并查詢相應(yīng)文獻，在實驗過程中也應(yīng)該注意內(nèi)參表達是否出現(xiàn)異常。

（2）在做多組織多細胞樣本對比表達量時，最好選用GAPDH作為內(nèi)參，因為GAPDH是代謝類蛋白，在活組織中表達比較恒定。而β-Actin和β-Tubulin是結(jié)構(gòu)蛋白，不同組織的細胞結(jié)構(gòu)會有差異性。

（3）在某些細胞中，由于組織缺氧、糖尿病等因素會導(dǎo)致GAPDH的表達增高，不適合做內(nèi)參。

（4）涉及細胞增殖的相關(guān)實驗中，c-Jun由于自身表達變化不適合做內(nèi)參。

（5）在做凋亡實驗時，TBP、Lamin等不適合作為內(nèi)參。

（6）做誘導(dǎo)后樣本或檢測磷酸化等修飾性抗體時，應(yīng)選擇結(jié)構(gòu)蛋白作為內(nèi)參，如β-Actin和β-Tubulin。

（7）做各種分泌液樣本的時候，如血漿、乳汁、組織液等，由于沒有完整的細胞結(jié)構(gòu)，只能選擇一些分泌蛋白作為內(nèi)參。

7. 驗證內(nèi)參抗體質(zhì)量：

（1）陽性對照實驗：用已知表達的樣本驗證抗體有效性。

（2）梯度上樣驗證：內(nèi)參條帶強度應(yīng)與上樣量呈線性關(guān)系。

（3）多內(nèi)參交叉驗證：高分文章標配，比如同時跑β-Actin和 GAPDH。

驗證數(shù)據(jù)