單克隆抗體由單一 B 淋巴細(xì)胞克隆產(chǎn)生的、氨基酸序列與空間構(gòu)象均一的免疫球蛋白。其核心特征是能專一識(shí)別并結(jié)合抗原分子上的單一抗原決定簇，具有特異性強(qiáng)、批次間差異小、可規(guī)?；a(chǎn)的特點(diǎn)，是生物制藥、精準(zhǔn)診斷及生命科學(xué)研究的核心工具。

一、單克隆抗體制備方法

目前對于單克隆抗體的開發(fā)一共有3大技術(shù)路線，一是傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)平臺(tái)，該技術(shù)篩選的是抗體分泌型漿B細(xì)胞（Plasma B cells）；二是噬菌體展示技術(shù)，該技術(shù)直接對B細(xì)胞進(jìn)行測序和建庫，抗體序列來源可以是漿細(xì)胞也可以是記憶細(xì)胞（Memory B cells）；三是基于單B細(xì)胞直接測序或者基于B細(xì)胞體外培養(yǎng)篩選后測序技術(shù)，該技術(shù)抗體序列來源可以是漿細(xì)胞也可以是記憶細(xì)胞。每種方法都具有獨(dú)特的優(yōu)勢和應(yīng)用，本期重點(diǎn)講解單B細(xì)胞抗體篩選技術(shù)。

二、單B細(xì)胞制備抗體流程

圖一：詳細(xì)實(shí)驗(yàn)流程

(I) B細(xì)胞分離
第一階段旨在分離專門針對所選抗原的單個(gè)B細(xì)胞。為此，單個(gè)B細(xì)胞被熒光標(biāo)記的抗原(蛋白質(zhì)、病毒粒子或表達(dá)抗原的細(xì)胞)染色并分類到多孔板中。圖一中，通過密度離心法從外周血中分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），然后用磁珠富集B細(xì)胞，并用熒光標(biāo)記的誘餌蛋白進(jìn)行單細(xì)胞分選，分選至 96 孔板中。

(II) PCR擴(kuò)增
第二階段進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后在嵌套或半套式多引物聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中擴(kuò)增自然配對的重鏈和輕鏈，可以通過測序分析擴(kuò)增的重鏈和輕鏈，以鑒定克隆關(guān)系并從分離的B細(xì)胞中推斷出譜系特征。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引物的選擇至關(guān)重要，因?yàn)樗鼈冃枰采w所有不同的V基因片段，不能在編碼V區(qū)引起突變，并且需要兼容以進(jìn)行多路復(fù)用。

(III) 克隆
第三階段在克隆階段，第一階段的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物在克隆聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(第三階段)中用計(jì)算優(yōu)化的引物混合物進(jìn)行擴(kuò)增，以將懸垂部分添加到哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，對于每條鏈，挑選單個(gè)克隆并用于接種96孔板液體培養(yǎng)和菌落PCR反應(yīng)混合物，對菌落PCR進(jìn)行測序分析，確定正確插入的可變區(qū)，并在液體培養(yǎng)中添加甘油進(jìn)行長期保存。

(IV) 抗體生產(chǎn)
對于高通量或大規(guī)模抗體生產(chǎn)，正確克隆的液體培養(yǎng)物或甘油庫存用于接種96孔小型(高通量)或搖瓶中尺度(大規(guī)模，低通量)細(xì)菌培養(yǎng)物，在高通量方案中，用96孔格式的質(zhì)粒-DNA隔離柱制備DNA，并以48孔或96孔格式轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，上清液可直接用于下游分析，如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)或微量中和分析，無需進(jìn)一步純化。為了規(guī)?；a(chǎn)，將重鏈和輕鏈的中型DNA導(dǎo)入HEK293-6E細(xì)胞，通過蛋白G親和純化純化單抗，用于下游檢測。

三、B細(xì)胞"技術(shù)"強(qiáng)勢賦能：抗體開發(fā)一步到位！

為縮短客戶的抗體開發(fā)周期、減輕研發(fā)負(fù)擔(dān)，斯達(dá)特推出了全新抗體開發(fā)平臺(tái)——兔單B細(xì)胞抗體開發(fā)技術(shù)平臺(tái)。與傳統(tǒng)抗體開發(fā)技術(shù)相比，我們的兔單B細(xì)胞技術(shù)平臺(tái)不僅能實(shí)現(xiàn)對特定B細(xì)胞的高特異性篩選，還能夠保留抗體重鏈和輕鏈的天然配對以提高抗體的親和力和功能性。

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