組織樣本的免疫熒光主要有兩種制備方式：石蠟切片和冰凍切片。兩者各有優(yōu)劣，適用場(chǎng)景也大不相同。

石蠟切片免疫熒光 (Paraffin section) 雖在組織形態(tài)保存和長期儲(chǔ)存方面具有優(yōu)勢(shì)，但其制備過程涉及高溫烘烤、二甲苯脫蠟等步驟^[1][2]，容易導(dǎo)致某些敏感蛋白 (如細(xì)胞表面受體、細(xì)胞因子、磷酸化蛋白等) 的抗原表位被破壞或掩蔽，使得抗體“認(rèn)不出"目標(biāo)蛋白，造成假陰性。此外，石蠟切片的制備周期較長，不適用于醫(yī)學(xué)病理檢測(cè)等場(chǎng)景。

相比之下，冰凍切片免疫熒光 (Frozen section immunofluorescence) 直接將新鮮或快速冷凍的組織置于低溫環(huán)境下進(jìn)行切片。這一過程極大地縮短了制片時(shí)間，同時(shí)保留了組織中的多種抗原免疫活性。免疫熒光技術(shù)則進(jìn)一步利用熒光標(biāo)記的抗體與組織中的特定抗原結(jié)合，通過熒光顯微鏡觀察，實(shí)現(xiàn)對(duì)抗原的精確定位和可視化^[3]。   

圖 1. 石蠟切片 (上) 和冰凍切片 (下) 流程^[2][4]。

首先，當(dāng)檢測(cè)敏感蛋白/低表達(dá)抗原時(shí)，石蠟切片的高溫、二甲苯脫蠟等步驟，會(huì)導(dǎo)致敏感蛋白抗原表位變性，讓抗體無法識(shí)別。冰凍切片低溫冷凍、不接觸高溫和有機(jī)溶劑，能保留抗原免疫活性，對(duì)細(xì)胞表面受體、磷酸化蛋白等敏感抗原的檢測(cè)靈敏度遠(yuǎn)高于石蠟切片。此外，珍貴、難重復(fù)取材的組織樣本也適合冰凍切片。

其次，在應(yīng)急診斷/手術(shù)中快速診斷時(shí)，石蠟切片制備需 2-3 天，無法滿足應(yīng)急需求。冰凍切片 30 分鐘內(nèi)可完成包埋切片，1-2 小時(shí)完成染色，是手術(shù)切緣判斷、急性病變?cè)\斷的一選擇，能為臨床決策及時(shí)提供依據(jù)^[1]。

此外，在進(jìn)行多抗原共定位分析時(shí)——石蠟切片：不同抗原修復(fù)條件不一，易出現(xiàn)修復(fù)不均問題；冰凍切片：無需抗原修復(fù)，可同時(shí)孵育多種一抗，實(shí)現(xiàn)多通道熒光標(biāo)記，清晰呈現(xiàn)多種抗原的空間分布關(guān)系。

冰凍切片免疫熒光詳細(xì)步驟^[4][5]：

快速取出新鮮組織 (如小鼠腦、肝、腎等)，用 1xPBS 沖洗去除血跡，浸沒在 4% PFA，放在 4℃ 固定 12-24 小時(shí)。

隨后將固定后的組織轉(zhuǎn)移至 15% 蔗糖溶液 (4℃)，待其都沉底 (約數(shù)小時(shí))；轉(zhuǎn)入 30% 蔗糖溶液 (4℃) ，繼續(xù)孵育直至再次都沉底 (一般過夜)，目的是為了脫去水分；

取出沉底的組織，用濾紙輕輕吸干表面多余水分。放入包埋模具中，用足量的 OCT 包埋劑都覆蓋組織，確保沒有氣泡。接著迅速放在干冰或液氮?dú)庀鄬舆M(jìn)行速凍，直至形成白色硬塊，取出后可立即放入 -80℃ 冰箱保存，或直接用于切片。

提前將 OCT 包埋塊放入冷凍切片機(jī)腔體 (溫度 -20℃ 左右)，平衡 30 分鐘。

修整組織表面，設(shè)置切片厚度 (一般 5-10 μm)。轉(zhuǎn)動(dòng)切片機(jī)輪盤，輔以防卷板，連續(xù)平整切片并貼附在防脫載玻片上，置于室溫晾干 30-60 分鐘后儲(chǔ)存于 -80℃ 或者直接進(jìn)行下一步。

將切片用 1xPBS 清洗 3 次，每次 5 min，目的是為了去除切片表面的 OTC，再甩去多余液體，在組織周圍用疏水筆畫圈，并向組織加入封閉液 (5% 正常山羊血清或 5% BSA+ 0.3% Triton X-100)，室溫孵育 1 h。

吸去封閉液，立即滴加合適比例的一抗，確保整個(gè)組織都覆蓋。將載玻片放回濕潤的盒子里，4℃ 冰箱過夜。接著取出后先放復(fù)溫至室溫，用 1xPBS 清洗 3 次，每次 5 min。

再滴加熒光標(biāo)記的二抗，室溫避光孵育 1 h。用 1xPBS 清洗 3 次，每次 5 min。

盡量吸干玻片上殘余的水分，在樣品處滴加含有 DAPI 的抗熒光淬滅封片劑，蓋上蓋玻片進(jìn)行封片，盡量排除氣泡。室溫通風(fēng)晾干 2-4 小時(shí)，或 4℃ 避光保存過夜。

使用熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡觀察并拍照。圖片可用 ImageJ 軟件進(jìn)行分析處理。

可能原因：封閉不充分；熒光二抗非特異性結(jié)合；組織樣品干燥時(shí)間長

解決方案：延長封閉時(shí)間；二抗種屬來源一致或使用；操作過程保持組織樣品濕潤。

可能原因：蔗糖脫水不全；冷凍速度太慢形成冰晶；封片時(shí)未排盡氣泡

解決方案：確保 30% 蔗糖都沉底；包埋時(shí)用液氮/干冰速凍；封片確保氣泡全部去除。

可能原因：載玻片材料不合適；切片未在室溫下復(fù)溫就染色。

解決方案：選用Superfrost Plus 防脫載玻片；室溫下復(fù)溫 30 min 左右。

其實(shí)！石蠟切片和冰凍切片，從來不是“對(duì)立關(guān)系"，而是“互補(bǔ)關(guān)系"——

(1) 如需做常規(guī)病理、長期存檔、不敏感抗原檢測(cè)，選石蠟切片，省心又穩(wěn)定；

(2) 如需做敏感抗原、低表達(dá)抗原、術(shù)中快速診斷，選冰凍切片，精準(zhǔn)又高效。

冰凍切片免疫熒光的核心優(yōu)勢(shì)是“保留抗原活性"，這是石蠟切片無論如何優(yōu)化都難以替代的。雖說冰凍切片步驟略多，但只要掌握正確方法，避開常見坑，就可獲得實(shí)驗(yàn)順利！

參考文獻(xiàn)