鏈霉親和素在轉(zhuǎn)錄組測序中的扮演著非常重要的角色。最早是用磁珠結(jié)合生物素化 oligo (dT)，從而特異性捕獲帶 poly (A) 尾的 mRNA。隨著研究深入，更前沿的表觀轉(zhuǎn)錄組與 RNA 測序結(jié)合，推動轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)向模塊化方向發(fā)展。

ONE-seq，是一種用于鑒定含有 NAD 加帽的 RNA 轉(zhuǎn)錄本的技術(shù)。它通過一步化學(xué)酶促反應(yīng)對 NAD 加帽 RNA 進行生物素化修飾，使其與鏈霉親和素結(jié)合，隨后利用 Nudix 磷酸水解酶 NudC 催化的洗脫，從鏈霉親和素磁珠 (HY-K0208) 上特異性地收集 NAD 加帽 RNA，用于高通量測序 (圖 1) 。

圖 1.ONE-seq 的工作流程^[1]。

生物素基團作為親和標(biāo)簽在 ADPRC 存在下，NAD 的煙酰胺部分可通過親核反應(yīng)被 HEEB 取代 (生物素化) ，隨后可通過鏈霉親和素磁珠進行富集。

RNA 結(jié)合蛋白 (RBPs) 是轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控的關(guān)鍵參與者，在眾多成熟方法中，蛋白質(zhì)下拉實驗 (PDs) 可能是受認(rèn)可和常用的方法。

通過將生物素化 RNA 錨定在鏈霉親和素包被的磁珠上，可以檢測其相互作用蛋白，從而實現(xiàn)核糖核蛋白 (RNP，是由 RNA 和蛋白質(zhì)組成的復(fù)合體) 的高效分離。這個方法的主要局限性在于生物素化探針的設(shè)計以及對其與靶蛋白結(jié)合能力的測試。

RNA-蛋白質(zhì)互作實驗的常規(guī)流程如圖 2。

圖 2.RNA-蛋白質(zhì)互作實驗流程示意圖^[2]。

(A) 將 Bioin-RNA 配制成適當(dāng)濃度的裂解緩沖液。(B) 洗滌磁性鏈霉親和素珠，然后結(jié)合 Bioin-RNA。(C) 將細胞的總蛋白提取物加到磁珠-RNA 混合物中。(D) 洗滌雜蛋白。(E) 洗脫目的蛋白。(F) 質(zhì)譜分析鑒定。

因為 RNA 與 RBP 的相互作用可以是穩(wěn)定的、易于實驗驗證的，也可以是高度動態(tài)的、瞬時的、更難以表征的。所以實驗的緩沖液體系有優(yōu)化的空間。

• 如果需要檢測下拉產(chǎn)物中核酸組分，可選擇 95% Formamide, 10 mM EDTA 作為洗脫液主要組分，95°C 煮樣后，用含有 7 M 尿素的 8% 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離鑒定^[3]。

• 如果是檢測下拉產(chǎn)物中蛋白質(zhì)，可以直接使用含有 50 mM DTT 的 1× SDS-PAGE 上樣緩沖液，煮沸后上樣^[3]。也有文獻使用 20 mM PBS (pH 7.5) 、1 M NaCl、0.5 mM EDTA、0.1% Triton X-100、1 mM DTT 洗脫磁珠上的蛋白后進行質(zhì)譜檢測^[2]。

圖 3.檢測 RIP 實驗中免疫沉淀的蛋白質(zhì) (上) 或 RNA (下)^[3]。

上圖：使用 FLAG 特異性抗體通過蛋白質(zhì)印跡法檢測裂解液 (L)、流穿液 (FT)、洗滌液 (W) 和免疫沉淀組分 (IP) 中的 KhpA-3xFLAG 或 KhpB-3xFLAG。下圖：Northern 印跡法檢測 FoxI、FunR16 或 FunR2。野生型菌株用作陰性對照。

鏈霉親和素-生物素體系也可以用于篩選生物素化小分子的靶標(biāo)蛋白。

例如，將生物素標(biāo)記的肌醇與鏈霉親和素磁珠孵育，然后再加入蛋白質(zhì)提取物孵育，通過磁性分離得到與肌醇特異性結(jié)合的蛋白。在該實驗中可以使用未標(biāo)記的肌醇消除生物素標(biāo)記的肌醇與其靶蛋白的結(jié)合，通過該步驟反向驗證肌醇與其靶蛋白存在結(jié)合 (圖 4) 。

圖 4.游離肌醇可消除生物素標(biāo)記的肌醇與其靶蛋白的結(jié)合^[4]。

(A) 將 PC3 細胞的細胞裂解液與 40 μM 生物素、40 μM 生物素標(biāo)記的肌醇 (Biotin-Ins) 或 4 mM 未標(biāo)記的肌醇 (Ins) 孵育；然后用鏈霉親和素磁珠下拉肌醇相互作用蛋白，并使用特異性 AMPKα、AMPKβ 和 AMPKγ 抗體進行免疫印跡分析。(B) 將 200 ng GST-AMPKγ1 與 40 μM 生物素、40 μM 生物素標(biāo)記的肌醇 (Biotin-Ins) 或 4 mM 未標(biāo)記的肌醇 (Ins) 孵育 2 小時，然后用鏈霉親和素磁珠進行下拉實驗。通過 GST 抗體免疫印跡法檢測相互作用。

使用磁珠進行樣品預(yù)清除是必要的步驟 (step 3)，可以減少非特異性結(jié)合，并在相互作用復(fù)合物組裝之前最大限度地減少非靶標(biāo)分子的共純化 (圖 5) 。

圖 5.生物素標(biāo)記肌醇下拉實驗流程^[4]。

當(dāng)然，內(nèi)源性生物素干擾是生物素下拉法篩選生物素化小分子的靶標(biāo)蛋白的一個痛點。

偷偷告訴你！如果生物素化小分子是在細胞生長過程中加入，建議使用 Alkyne 基團標(biāo)記的小分子，在樣品預(yù)清除生物素步驟之后，再和 Biotin-azide 通過點擊化學(xué)反應(yīng)標(biāo)記上生物素，再進行磁珠下拉實驗，可以有效規(guī)避內(nèi)源性生物素干擾。

不過，最新的研究表明，合成的鏈霉親和素的對映體，能夠特異性結(jié)合 L-生物素，而不識別內(nèi)源性 D-生物素^[5]。該技術(shù)的推廣還需要時間驗證，讓我們一起拭目以待吧~

在細胞膜蛋白研究中，可以利用鏈霉親和素-生物素體系對細胞表面蛋白進行高度特異、溫和且可富集的標(biāo)記、分離和檢測。實驗時要先使用生物素化試劑，對細胞外結(jié)構(gòu)域或者膜蛋白進行標(biāo)記。

例如，在腸道菌與宿主腸道細胞互作機制的研究中。使用膜通透性差的生物素標(biāo)記宿主細胞表面的膜蛋白。然后使用溫和的細胞裂解液 (1% NP-40 等) ，裂解細胞，提取細胞膜蛋白；細菌的裂解則需要加入溶菌酶 (300 μg/mL) 和 1% (v/v) Triton X-100，并加入 DNase I (10 mg/mL) 和 MgCl? (10 mM) 以去除粘稠的核酸，以得到細菌表面的蛋白。進行下拉實驗時先將細胞膜蛋白與磁珠孵育，再與細菌膜蛋白孵育^[6]。

             

圖 6. 利用生物素下拉法驗證口部假單胞菌粘附素與宿主細胞的結(jié)合^[6] 。

實驗流程 (左) 。生物素標(biāo)記的 HT29 (中) 和 CACO-2 (右) 下拉樣品的銀染。候選粘附素的質(zhì)譜分析。