對于碎片和灰塵的誤計，有效的解決方案是修改 Gating（門限） 參數(shù)。儀器可以高效地忽略形狀不規(guī)則且染色較深的碎片（即不規(guī)則性），也能通過設(shè)置尺寸下限來排除小于特定直徑的物體。

一、解決方案：修改Gating參數(shù)（明場計數(shù)）

1、進(jìn)入設(shè)置界面：完成一次計數(shù)后，在結(jié)果（Results）屏幕上，點擊 Gating 按鈕。

2、調(diào)整參數(shù)滑塊：在彈窗中選擇明場（BF）通道，重點修改以下兩個參數(shù)：

（1）尺寸 (Size)：這是過濾碎片最直接的參數(shù)。碎片和灰塵通常比目標(biāo)細(xì)胞小得多。建議將下限（Bottom Gate）** 從默認(rèn)值調(diào)高，例如 5μm或 7μm，這將有效地將所有小于該尺寸的物體排除在計數(shù)之外，從而有效去除碎片和小顆粒。同時，確保尺寸上限（Top Gate）能覆蓋您的細(xì)胞直徑。

（2）圓度 (Circularity)：碎片形狀往往不規(guī)則，而細(xì)胞通常呈圓形。通過修改圓度參數(shù)，可以基于形狀篩選細(xì)胞，使不規(guī)則形狀的碎片不被計數(shù)。建議將下限（Bottom Gate）** 適當(dāng)調(diào)高，以排除這些不規(guī)則物體。

3、保存為新模板：優(yōu)化后，務(wù)必點擊 Save 按鈕，將其保存為一個新的模板（Protocol），確保后續(xù)操作的一致性。

二、排查清單：識別并消除干擾因素

1、優(yōu)化樣品制備，從源頭減少雜質(zhì)

（1）純凈染料與試劑：臺盼藍(lán)染料自身可能含有沉淀，這些沉淀物會被誤認(rèn)為小細(xì)胞。使用前可通過0.22μm或0.3μm濾膜過濾或離心（2,000-3,000 rpm，5-10 min） 去除，并避免劇烈混勻。

（2）減少細(xì)胞碎片：優(yōu)化胰酶消化時間，通過低速離心去除死亡細(xì)胞碎片，并確保培養(yǎng)液清澈。

（3）確保單細(xì)胞懸液：上機(jī)前用移液器輕輕吹打細(xì)胞懸液，確保細(xì)胞分散均勻。

（4）移液前充分混勻：上樣前務(wù)必充分混合樣品。建議采用溫和渦旋或“手指輕彈”混勻，然后再移液，以避免細(xì)胞沉底導(dǎo)致的濃度不均。

2、優(yōu)化儀器設(shè)置與成像

（1）檢查焦點：確保細(xì)胞成像清晰。焦距不準(zhǔn)會使活細(xì)胞邊緣模糊、整體偏暗，易被誤判為死細(xì)胞或碎片，這需要重新聚焦。

（2）調(diào)整亮度閾值：過于暗淡的碎片也會被誤認(rèn)為死細(xì)胞。可以在Gating中設(shè)置亮度下限（Brightness Bottom Gate），排除過暗的物體。

（3）排除邊緣計數(shù)：檢查設(shè)置，確保其只計數(shù)圖像中央的有效區(qū)域，而忽略邊緣。您可以檢查Protocol中的Count Areas設(shè)置是否已禁用邊緣計數(shù)。

（4）使用自動設(shè)置：如果手動調(diào)整后效果不佳，可嘗試重置并開啟儀器的自動設(shè)置，或選擇接近您細(xì)胞類型的預(yù)設(shè)模板作為起點。

（5）確保玻片潔凈：使用潔凈的玻片并避免指紋或灰塵污染，保證成像清晰。

三、替代方案與驗證方法

1、利用儀器特性：Countess 3/3 FL等新型號的算法本就具備自動排除碎片的功能。也可通過USB鼠標(biāo)連接儀器，嘗試重新安裝軟件，這有時能解決因軟件故障導(dǎo)致的誤判問題。

2、切換到熒光計數(shù)：如果您的儀器是Countess FL或3 FL型號，強(qiáng)烈建議嘗試 AO/PI（吖啶橙/碘化丙啶）雙染熒光法。熒光染料僅對帶有細(xì)胞核的完整細(xì)胞染色，可排除無核的碎片。

3、檢查儀器硬件：若硬件（如鏡頭、光源）出現(xiàn)異常，也可能導(dǎo)致誤判。請按照說明書清潔鏡頭等關(guān)鍵組件，并參照產(chǎn)品說明定期進(jìn)行維護(hù)或檢查。

4、聯(lián)系技術(shù)支持：如果上述方法均無效，建議聯(lián)系賽默飛技術(shù)支持或?qū)で髢x器的售后服務(wù)，排查是否存在需要專業(yè)校準(zhǔn)的硬件問題。

四、總結(jié)

解決碎片與灰塵誤計的核心在于調(diào)整Gating參數(shù)中的尺寸（Size）和圓度（Circularity），并結(jié)合潔凈的樣品與正確的焦距。通過優(yōu)化這些設(shè)置并確保樣本和儀器的潔凈，您將能獲得更精確的計數(shù)結(jié)果。如果問題依然存在，切換到熒光檢測模式是有效的驗證和替代手段。