本文要點(diǎn)：NIR-Ⅱ熒光成像具有更少的組織散射和自發(fā)熒光，實(shí)現(xiàn)了更深的組織穿透深度和更高的分辨率。但是大多數(shù)有機(jī)NIR-Ⅱ熒光團(tuán)具有較低的熒光量子產(chǎn)率和較差的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。傳統(tǒng)上通過化學(xué)修飾來解決，但是不僅化學(xué)合成過程繁瑣而且有些花菁類染料結(jié)構(gòu)上沒有可以修飾的單元。作者通過基因工程合成了一系列白蛋白片段和包含一個(gè)或者多個(gè)結(jié)構(gòu)域的重組蛋白，這些白蛋白變體會(huì)保護(hù)插入的染料，使它們的熒光亮度提高。通過對白蛋白變體進(jìn)行基因編輯，可以實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)“定制"藥代動(dòng)力學(xué)；還可以通過生物功能小分子修飾，實(shí)現(xiàn)體內(nèi)成像。近紅外二區(qū)小動(dòng)物活體熒光成像系統(tǒng) - MARS

圖1.復(fù)雜設(shè)計(jì)和結(jié)合機(jī)理的示意圖

a）左：HSA的結(jié)構(gòu)。DIIIa用綠色突出顯示，DIIIb用橙色突出顯示。右：DIIIa（綠色）和DIIIb（橙色）的分裂α-螺旋(h)結(jié)構(gòu)。b）野生型白蛋白可以通過基因工程產(chǎn)生與花菁類染料結(jié)合的片段和重組蛋白，并且產(chǎn)生大小和亮度可調(diào)的復(fù)合體。將重組質(zhì)粒DIII、DIIIa（包裹花菁類染料的最小功能單位）和TDIII（三個(gè)DIII序列串聯(lián)）插入載體（巴斯德畢赤酵母：pPIC9載體）。c）生色團(tuán)涂層可以用生物功能分子進(jìn)行生物或化學(xué)修飾。b）花菁類染料與白蛋白變體相互作用的機(jī)理。左：機(jī)理涉及兩個(gè)獨(dú)立的階段。ｄｉ一階段：將花菁類染料插入疏水蛋白口袋中，通過非共價(jià)鍵緊密結(jié)合。第二階段：含氯的花菁類染料與蛋白質(zhì)的特定殘基形成共價(jià)鍵。中：含氯的花菁類染料在DIII中準(zhǔn)確結(jié)合位置的3D結(jié)構(gòu)。綠色（賴氨酸475）、紫（苯丙氨酸458）和灰色（精氨酸472和精氨酸484）代表參與ｄｉ一階段協(xié)同超分子相互作用的殘基。右：結(jié)合袋中的Cys476被證明是結(jié)合殘基。

HSA中有三個(gè)結(jié)構(gòu)域（DⅠ、DⅡ、DⅢ），DⅢ結(jié)構(gòu)域中有a、b兩個(gè)亞基（圖1a），花菁類染料插入DⅢa亞基的疏水口袋中，通過非共價(jià)鍵連接，含氯花菁類染料上的氯與疏水口袋中半胱氨酸467發(fā)生親核取代反應(yīng)，通過共價(jià)鍵連接（圖1d）。利用畢赤酵母表達(dá)DⅢ、DⅢa、TDⅢ重組蛋白，與染料結(jié)合后產(chǎn)生不同的熒光強(qiáng)度和藥代動(dòng)力學(xué)（圖1b）。還可以用生物功能小分子修飾蛋白質(zhì)涂層，產(chǎn)生具有生物功能特性的長波長熒光團(tuán)，便于用于體內(nèi)成像。

圖2.花菁類染料與DIII結(jié)合使熒光增強(qiáng)作用

a）IR-783@DIII的吸收光譜、NIR-Ⅰ發(fā)射光譜和NIR-Ⅱ發(fā)射光譜。Ab：吸收光譜；Si Em：使用硅相機(jī)記錄的發(fā)射光譜；InGaAs Em：用InGaAs相機(jī)記錄的發(fā)射光譜。b、c）IR-783@DIII（1：1）在室溫（RT）和60℃下的NIR-I熒光增強(qiáng)在NIR-Ⅰ區(qū)域（b）和NIR-Ⅱ區(qū)域（c）。d、e）用電泳法分析IR-783與DⅠ、DⅡ、DⅢ、HSA、BSA混合物在白光下（d）和在>1000nm的熒光下。f）具有不同蛋白質(zhì)與染料摩爾比的IR-783@DIII和IR-783@HSA的NIR-II圖像。g）填充IR-783@DIII溶液的毛細(xì)管在1%磷脂中浸泡到不同深度的熒光圖像。h）IR-783與DIII（上）或HSA（中）以及ICG與DIII（下）的動(dòng)力學(xué)結(jié)合分析結(jié)果。i-k）與在PBS中游離染料的熒光強(qiáng)度相比，不同花菁類染料與BSA、HSA（i）、DⅠ、DⅡ、DⅢ（j）結(jié)合之后熒光強(qiáng)度增強(qiáng)的對比。

首先，篩選重組人血清白蛋白（HSA）的結(jié)構(gòu)域，來確定花菁類染料與白蛋白準(zhǔn)確的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。如圖2a-c所示，當(dāng)IR-783與DⅢ結(jié)構(gòu)域結(jié)合的時(shí)候，在NIR-Ⅰ（發(fā)射峰在810nm）、NIR-Ⅱ（拖尾峰）的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，甚至高于IR-783與HSA混合物的熒光強(qiáng)度。如圖2d、2e所示，電泳實(shí)驗(yàn)展現(xiàn)出一樣的結(jié)果，這些實(shí)驗(yàn)表明DⅢ可能是IR-783的結(jié)合口袋。同時(shí)可以觀察到隨著IR-783的負(fù)載量，HSA和BSA的熒光強(qiáng)度降低，游離IR-783對應(yīng)的NIR-Ⅱ的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。但是IR-783與DⅢ的摩爾比從1：1增加到3：1時(shí)，表現(xiàn)出相似的熒光強(qiáng)度。說明高負(fù)載量會(huì)使IR-783@HSA發(fā)生熒光淬滅，但是對IR-783@DⅢ沒有影響。與NIR-I窗口相比，在NIR-II窗口中可以對IR-783@DIII進(jìn)行更深層次的成像（圖2g）。

接下來，研究一系列的花菁類染料，來確定與白蛋白緊密結(jié)合的染料。這一系列染料除了DiR之外，都與白蛋白具有高親和力。如圖2h所示，IR-783與DⅢ具有更高的結(jié)合親和力，結(jié)合的更快，解離的更慢。如圖2i所示，一部分染料與HSA和BSA結(jié)合之后，比起游離的染料熒光強(qiáng)度顯著更強(qiáng)。進(jìn)一步研究熒光增強(qiáng)是否與DⅢ結(jié)合有關(guān)系，這一系列染料與DⅢ結(jié)合之后，熒光強(qiáng)度或多或少的增加。結(jié)果表明，熒光強(qiáng)度與結(jié)合的姿勢有關(guān)，而與高親和力無關(guān)。

圖3.花菁類染料與DIII相互作用的機(jī)理

a）UHPLC-MS分析表明，DIII與插入的花菁類染料之間形成了共價(jià)鍵。質(zhì)量增加為691m/z，相當(dāng)于IR-783去除Cl的分子量。b）含Cl和無Cl染料的核結(jié)構(gòu)，有些花菁類染料不含紅色基團(tuán)。c）花菁類染料與DⅢ及其變體的相互作用有兩個(gè)獨(dú)立階段。d）HSA與菁染料有兩個(gè)結(jié)合部位：一個(gè)位于DⅠa的表面（游離的Cys34是唯ｙｉ含有游離巰基的天然胱氨酸），另一個(gè)位于DIIIa的疏水口袋中（在Cys475形成共價(jià)鍵）。e）與HSA或BSA相比，大多數(shù)與DIII結(jié)合的花菁類染料的熒光強(qiáng)度都增強(qiáng)了（1.3-5.9倍）f）染料@HSA的熒光增強(qiáng)程度低于染料@DIII，這是因?yàn)榕cDI結(jié)合的染料對DIII疏水口袋中結(jié)合的熒光增強(qiáng)染料表現(xiàn)出分子內(nèi)猝滅。g）TICT誘導(dǎo)IR-783（頂部）和ICG（底部）的NIR-I和NIR-II的DFT和TDDFT計(jì)算。h-j）蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明，Cys475有助于共價(jià)鍵的形成。含有染料修飾的半胱氨酸氨基酸的三電荷胰蛋白肽的MS/MS（i）和碎片質(zhì)量（j）。用基于Orbitrap的質(zhì)量分析儀(<0.5ppm)獲得了完整的y系列離子(y1-y8)。這些離子被標(biāo)記在光譜上，并被描繪在序列上。

如圖3a所示，兩者的分子量的差剛好是IR-783除去Cl的分子量，說明DIII與插入的花菁類染料之間形成了共價(jià)鍵。所以含氯的花菁染料通過共價(jià)鍵與DIII結(jié)合，而無氯的染料通過非共價(jià)的超分子相互作用與DIII結(jié)合（圖3b、c）。接著研究了HSA與花菁類染料的結(jié)合，如圖3d所示，HSA結(jié)構(gòu)域存在兩個(gè)獨(dú)立的染料結(jié)合位點(diǎn)，一個(gè)是DⅠa亞結(jié)構(gòu)域中cys34（對熒光增強(qiáng)沒有貢獻(xiàn)），一個(gè)是DⅢa亞結(jié)構(gòu)域中的疏水口袋（類似于DⅢ上染料結(jié)合位點(diǎn)），在空間上靠的近，當(dāng)?shù)鞍赘呷玖县?fù)載時(shí)會(huì)發(fā)生分子內(nèi)淬滅，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低（圖2e、2f、3f）。如圖3g所示，IR-783和ICG表現(xiàn)出類似的扭曲分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（TICT），這表明熒光增強(qiáng)不能歸因于共價(jià)鍵的形成。接下來用鳥ｑｉａｎｇ法蛋白組學(xué)研究花菁類染料與白蛋白之間反應(yīng)機(jī)理，結(jié)果表明，Cys476殘基存在疏水口袋中，含Cl的花菁類染料中的Cl可以與Cys476中的硫醇（SH-）發(fā)生親核取代反應(yīng)。所以DⅢ與花菁類染料相互作用分為兩個(gè)階段：ｄｉ一階段，染料插入DIII的疏水口袋并通過非共價(jià)相互作用與口袋結(jié)合，通過增強(qiáng)TICT來增強(qiáng)亮度；在第二階段，cys476的SH-與染料的Cl-通過親核取代形成“卡環(huán)"，穩(wěn)定口袋中含氯的染料。

圖4.與游離染料相比，染料@DIII顯示出更好的藥代動(dòng)力學(xué)，也可以用靶向分子進(jìn)行修飾

a）注射游離IR-783或IR-783@DIII的小鼠的NIR-II圖像。Li：肝; Ki：腎臟; In：腸。b）肝和腎中游離IR-783和IR-783@DIII的信背比。c）注射IR-780@DIII或ICG@DIII小鼠的NIR-II圖像。d）左：用生物功能分子TATE和PSMA-617編輯DIII涂層的過程示意圖。右：游離IR-783、IR-783@DIII、IR-783@DIII-分子結(jié)合物和DⅢ的NIR-II圖像。e、f）用UHPLC-MS分析證實(shí)PSMA-617或TATE成功修飾了DIII。（3-5個(gè)分子可成功偶聯(lián)到1個(gè)DIII上）。g、h）過表達(dá)SSTR的AR42J細(xì)胞攝取IR-783@DIII-TATE的NIR-II顯微鏡圖像（g）和過表達(dá)PSMA的PC3-PIP細(xì)胞攝取IR-783@DIII-PSMA-617的NIR-II顯微鏡圖像（h）。i-j）注射IR-783@DIII-Tate（i）的AR42J荷瘤小鼠的NIR-II圖像以及靶向和非靶向復(fù)合體在12h的生物分布（j）。k）注射IR-783@DIII-PSMA-617的PC3和PC3-PIP荷瘤小鼠的NIR-II顯微鏡圖像。

首先研究用DⅢ會(huì)如何改變花菁類染料在體內(nèi)行為。如圖4a、b所示，當(dāng)給小鼠注射游離IR-783時(shí)，該染料立即在肝臟中積累，之后染料重新分布到脾和腸道，屬于肝膽清除。相比之下，IR-783@DIII立即在腎臟中積累，然后迅速重新分布到膀胱，屬于腎臟清除。接著比較注射IR-780@DIII（含氯染料）和ICG@DIII（無氯染料），發(fā)現(xiàn)只有含氯的染料才會(huì)改變體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)（圖4C）。所以，DIII可以作為含氯花菁類染料的保護(hù)性共價(jià)涂層，為超亮NIR-II成像提供量身定制的藥代動(dòng)力學(xué)。

接著用生物功能小分子修飾DⅢ，如圖4d所示，用TATE和PSMA-617分別修飾在DⅢ上，雖然熒光強(qiáng)度比起沒修飾前下降，但是要強(qiáng)于游離染料。在細(xì)胞成像中用生物功能小分子修飾過的染料具有良好的靶向能力（圖4g、h）。同樣在荷瘤小鼠中也具有良好的靶向性，在注射后3小時(shí)內(nèi)在腫瘤內(nèi)積聚，并隨著時(shí)間的推移而增加（圖4i-k）。

圖5.與染料@DIII相比，染料@DIIIa顯示出更好的藥代動(dòng)力學(xué)和可編輯特性

a）用重組畢赤酵母表達(dá)DIIIa。b）DIIIa和DIIIb的電泳結(jié)果。c）IR-783、ICG和IR-780與DIII、DIIIa或DIIIb結(jié)合的NIR-II圖像。d、e）側(cè)位（d）和仰臥位（e）注射IR-783@DIIIa的健康小鼠的NIRII圖像。f）IR783@DIIIa-TATE的示意圖。g、h）注射IR-783@DIIIa-TATE的AR42J荷瘤小鼠的NIR-II圖像（g）和腫瘤與肌肉的比率（h）。

首先在畢赤酵母中表達(dá)出DIIIa和DIIIb（圖5a）。如圖5c所示，IR-783@DIIIa的亮度與IR-783@DIII相當(dāng)，ICG和IR-780也是表現(xiàn)出相同結(jié)果。所以DⅢ結(jié)構(gòu)域中與花菁類染料結(jié)合的亞基是DIIIa。由于DIIIa是DIII的片段，它的分子量大約是DIII的一半，因此推測IR-783@DIIIa的腎臟排泄率將高于IR-783@DIII。于是在健康小鼠體內(nèi)注射IR-783@DIIIa，用于評估它的藥代動(dòng)力學(xué)特性，發(fā)現(xiàn)在膀胱中它的積累速度比起IR-783@DIII更快，所以DIIIa可以提供小分子樣的藥代動(dòng)力學(xué)特性并且不損害熒光亮度。接著在荷瘤小鼠注射，發(fā)現(xiàn)與IR-783@DIIIa相比，IR-783@DIIIa-TATE在腫瘤部位的蓄積顯著增加(圖5g、h)。

圖6.Dye@TDIII表現(xiàn)出白蛋白樣藥動(dòng)學(xué)和2.7倍的亮度增強(qiáng)

a）用重組畢赤酵母表達(dá)TDIII。b）TDIII1（linker：Leu-Glu）和TDIII2（linker：-[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]2-）的電泳結(jié)果。c）隨著染料與蛋白摩爾比從0.25：1增加到16：1，染料與白蛋白、DIII、TDIII的混合物熒光強(qiáng)度的變化趨勢。d）比較IR783@TDIII和IR-783@HSA的半衰期。e、f）注射IR-783@TDIII的剃毛小鼠顱骨下血管的高倍率（2.5倍）NIR-II圖像（e）和ROI分析（f）。g-i）注射IR-783@TDIII的先天性淋巴水腫小鼠的高倍率（2.5倍）NIR-I和NIR-II圖像（g）、橫截面強(qiáng)度分布（h）和ROI分析（i）。j）PC3腫瘤的高倍率（2.5倍）NIR-II圖像。

長循環(huán)探針適用于淋巴和血管成像，但是染料@DⅢ/DIIIa通過腎臟迅速被清除，不能起到長循環(huán)探針的作用。IR-783@白蛋白是一種長循環(huán)探針，循環(huán)時(shí)間為19天，與內(nèi)源性蛋白相當(dāng)。假設(shè)將三個(gè)結(jié)構(gòu)域替換為DⅢ結(jié)構(gòu)域，也將保留內(nèi)源性蛋白的一些性質(zhì)。于是在畢赤酵母中表達(dá)TDIII（圖6a），并且用電泳鑒定(圖6b)。接著進(jìn)行光度滴定實(shí)驗(yàn)，如圖3c所示，來評估TDIII的載染料能力，發(fā)現(xiàn)只有染料與TDⅢ的摩爾比為3：1時(shí)熒光強(qiáng)度ｚｕｉ大，并且當(dāng)摩爾比為0.5：1、0.75：1和1：1時(shí)，熒光強(qiáng)度與DIII相當(dāng)，所以結(jié)果表明TDIII的染料載量約為DIII的3倍，但較高的染料載量也會(huì)導(dǎo)致自猝滅。

接下來研究TDIII在高分辨率血管、淋巴成像和先天性淋巴水腫檢測中的應(yīng)用。對比注射IR-783@TDIII和IR-783@HSA的健康小鼠，發(fā)現(xiàn)它們在體內(nèi)的半衰期類似，說明IR-783@TDIII也是長循環(huán)探針。接著IR783@TDIII對血管進(jìn)行了實(shí)時(shí)近紅外成像，發(fā)現(xiàn)可以對淺層皮下血管成像。于是嘗試勾勒出深層血管，如圖6e、f所示，對頭骨和皮膚下的血管實(shí)現(xiàn)高分辨率成像。最后探索對淋巴結(jié)和淋巴管成像，如圖6g、h所示，監(jiān)測一只患有先天性淋巴水腫的小鼠，清晰看到彎曲的淋巴管和水腫的淋巴結(jié)。同時(shí)，還可以使用高倍率NIR-II成像來描繪PC3腫瘤血管(圖6j)。

圖7.Dye@TDIII促進(jìn)高質(zhì)量的成像引導(dǎo)手術(shù)

a-c）IR-783@HSA和IR-783@TDIII在連續(xù)激光照射下的光穩(wěn)定性。d）動(dòng)物影像引導(dǎo)手術(shù)導(dǎo)航平臺(tái)。e、f）在有無室內(nèi)照明條件下，瘤內(nèi)注射IR-783@TDIII的小鼠轉(zhuǎn)移瘤旁淋巴結(jié)切除前后的NIR-II圖像。g-j）通過腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的原位乳腺癌小鼠的生物發(fā)光和NIR-II圖像。生物發(fā)光成像用于監(jiān)測腫瘤的進(jìn)展和前哨淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移。黃色箭頭表示轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)。

目前，臨床上使用的花菁類染料具有快速光漂白和清除的缺點(diǎn)，探索IR-783@TDIII是否可以解決這些問題。首先，如圖7a-c所示，與IR-783@HSA相比，IR-783@TDIII具有更高的光穩(wěn)定性。接著，如圖7d-f所示，將IR-783@TDIII注射到4T1荷瘤小鼠體內(nèi)，確定前哨淋巴結(jié)的位置。在明亮的光照和激光照射下進(jìn)行成像引導(dǎo)手術(shù)，發(fā)現(xiàn)前哨淋巴結(jié)可以被精確定位和切除。接下來，研究IR-783@TDIII在原位4T1乳腺癌模型中的成像性能，如圖7g-j所示，使用IR-783@TDIII可以在明亮的房間照明下捕獲轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)的高質(zhì)量熒光圖像。

總結(jié)：開發(fā)了一種簡單的策略來設(shè)計(jì)明亮和可編輯的NIR-II熒光團(tuán)，使它具有定制的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。通過用蛋白質(zhì)外殼包裹中心發(fā)射團(tuán)花菁類染料，來獲得更高的熒光亮度和良好的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。并且，還可以通過修飾蛋白質(zhì)外殼（與生物小分子結(jié)合、改變蛋白質(zhì)外殼大?。?，來獲得需要的清除途徑和藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。

參考文獻(xiàn)

doi.org/10.1038/s41467-022-30304-9

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