嵌合抗原受體T細胞 (CAR-T 細胞) 療法是一種免疫細胞治療。嵌合抗原受體 (CAR) 主要由識別腫瘤特異性抗原的單鏈抗體 (scFv) 段、鉸鏈區(qū)及跨膜段、共刺激分子結(jié)構(gòu)域和 CD3ζ 結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。通過病毒/非病毒載體將編碼 CAR 的基因引入T細胞，使T細胞實現(xiàn)不依賴于主要組織相容性復(fù)合體 (MHC) 抗原遞呈系統(tǒng)的特異性殺傷，是 CAR-T 細胞細胞治療的核心^[1]。

CAR-T 細胞療法近年來在血液系統(tǒng)惡性腫瘤治療領(lǐng)域取得了重大突破，顯著提升了各類血液腫瘤病癥的緩解率及長期生存率^[1]。

目前已獲批的所有 CAR-T 細胞產(chǎn)品，以及絕大多數(shù)處于臨床試驗階段的細胞療法，均采用患者自體 T 細胞進行體外制備。

如圖所示，傳統(tǒng)體外 CAR-T 療法存在諸多局限：體外制備流程復(fù)雜，從 T 細胞采集到 CAR-T 細胞輸注通常需要數(shù)周時間，成本高昂，患者 T 細胞功能受損可能影響療效，多次給藥難度大，且臨床表現(xiàn)不穩(wěn)定等。

圖 1. 體外細胞療法的制造策略概述^[2]。

體內(nèi) CAR-T 細胞工程，即 CAR-T 細胞直接在患者體內(nèi)生成^[3]。

體內(nèi) CAR-T 療法簡化了體外 CAR-T 療法，通過全身給藥的方式將 CAR 基因編輯構(gòu)建體包裹在病毒載體或納米顆粒中。這些載體特異性地靶向 T 細胞，釋放基因編輯載荷，從而誘導(dǎo) CAR 構(gòu)建體在 T 細胞表面表達。由此產(chǎn)生的 CAR-T 細胞能夠特異性地識別癌細胞，進而激活自身并擴增，最終有效清除血液或惡性腫瘤中的癌細胞^[4]。

圖 2. 體內(nèi) CAR - T 治療癌癥的示意圖^[4]。

目前，體內(nèi) CAR-T 細胞工程策略主要分為基于病毒載體和合成非病毒遞送系統(tǒng) (如 LNP) 的兩大技術(shù)路線，旨在體內(nèi)直接將患者自身的 T 細胞改造為 CAR-T 細胞，實現(xiàn)腫瘤的原位殺傷。

這些策略包括：①使用脂質(zhì)納米顆粒 (LNP) 包裹的核酸 (mRNA 或質(zhì)粒 DNA) ；②聚合物納米顆粒包裹的核酸 (mRNA 或質(zhì)粒 DNA) ；③慢病毒或腺相關(guān)病毒 (AAV) 遞送系統(tǒng)；④生物指導(dǎo)性植入支架的混合策略；⑤ 以及 Cas9 包裝的包膜遞送載體 (Cas9-EDV) 和病毒模擬融合納米囊泡 (FuNV)^[3]。

             

圖 3. 體內(nèi) CAR-T 療法遞送平臺^[3]。

a. LNP 或聚合物通過與 T 細胞抗原 (如 CD3、CD4、CD5 和 CD8) 的相互作用，被抗體或抗體片段功能化以選擇性地結(jié)合 T 細胞。mRNA 然后在細胞質(zhì)中的核糖體上被翻譯，導(dǎo)致 CAR 分子的表達，從而暫時生成功能性的 CAR-T 細胞。b. 使用包裹在聚合物中的編碼 CAR 的 DNA 進行體內(nèi) CAR-T 細胞生成的機制。同樣，聚合物載體被 T 細胞靶向抗體功能化，并通過內(nèi)吞作用被內(nèi)化，導(dǎo)致 DNA 有效載荷釋放到細胞質(zhì)中。c.慢病毒遞送載體通常被病毒來源的糖蛋白偽型化，并與靶向 T 細胞的分子偶聯(lián)。它們與 T 細胞結(jié)合后，病毒RNA 被逆轉(zhuǎn)錄成 DNA。編碼 CAR 的轉(zhuǎn)基因隨后被轉(zhuǎn)錄成 mRNA，mRNA 被運輸?shù)郊毎|(zhì)并翻譯成 CAR 蛋白。d.基于海藻酸鹽或膠原的支架中嵌入患者來源的外周血單個核細 (PBMCs) 或分離的 T 細胞。除了用人體 T 細胞直接種植外，該支架還可以通過建立趨化因子梯度或通過局部釋放細胞因子，在體內(nèi)募集內(nèi)源性 T 細胞。該支架促進病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，并作為體內(nèi)生成和釋放功能 CAR-T 細胞的平臺。e. Cas9-EDVs 采用類似逆轉(zhuǎn)錄病毒的顆粒組裝機制，結(jié)合靶向分子。內(nèi)化后，融合白病毒樣淀粉樣蛋白病毒糖蛋白 (VSV-G) 的突變形式。

與病毒載體相比，非病毒遞送載體的結(jié)構(gòu)可設(shè)計性強、免疫原性較低、生產(chǎn)工藝相對簡單，是實現(xiàn)體內(nèi) CAR-T 工程化的一種更靈活的替代策略。其中，抗體靶向脂質(zhì)納米顆粒 (Ab-LNPs) ，即 LNP 表面連接靶向抗體，因其增強的特異性和治療效果，已成為靶向治療遞送的一種前沿策略。

Ab-LNPs 的設(shè)計是一個復(fù)雜的過程，LNP 的組成、抗體的性質(zhì)、LNPs 表面抗體密度都會影響靶向效率、抗原親和力和內(nèi)化速率等。

Ab-LNPs 這種復(fù)雜顆粒系統(tǒng)的主成分如圖所示 (圖 5) ?？筛鶕?jù)治療藥物的不同，選擇不同的脂質(zhì)組成：就小分子藥物而言，常選擇由磷脂和膽固醇構(gòu)成的傳統(tǒng)脂質(zhì)體；對于諸如小干擾 RNA (siRNA) 和 mRNA 等基于核酸的療法的遞送，LNPs 通常由可離子化的和結(jié)構(gòu)化的脂質(zhì)組成。

一句話：脂質(zhì)體通常用于小分子藥物的封裝，而離子化脂質(zhì)則更適用于核酸的封裝。

圖 5. 針對 Ephrin A2 (EphA2) 的 Ab-LNP 的示意圖^[5]。

pH 敏感型紫杉烷類免疫脂質(zhì)體的示意圖。從外到內(nèi)依次為：(a) Ephrin A2 抗體作為活性靶向配體，以脂質(zhì)-scFv 偶聯(lián)物 (scFv-PEG-DSPE) 的形式插入脂質(zhì)雙層；(b) 聚乙二醇二硬脂酰甘油 (PEG-DSG) 用于延長循環(huán)時間，鞘磷脂/膽固醇/PEG-DSG 脂質(zhì)基質(zhì)用于提高穩(wěn)定性；(c) SOS 作為載藥助劑，用于高效穩(wěn)定地包封紫杉烷類前藥。粒徑約為 110 nm，用于被動靶向。

靶向機制！脂質(zhì)納米顆粒 (LNP) 表面修飾的靶向抗體可顯著提升其特異性，是實現(xiàn)精準遞送的關(guān)鍵手段。通過將抗體偶聯(lián)至 LNP 表面，借助抗體的靶向特異性，可將納米顆粒引導(dǎo)至特定細胞或組織，進而在靶部位遞送治療有效載荷。

為了讓 Ab-LNP 更好地發(fā)揮作用，抗體需滿足：①高特異性，能精準識別目標細胞，減少脫靶效應(yīng)；②低免疫原性，避免引起患者的免疫反應(yīng)；③存在能夠和 LNP 結(jié)合的位點，且不影響自身的功能。

因此，Ab-LNPs 對抗體結(jié)構(gòu)的選擇具有尺寸依賴性，通常更傾向于采用結(jié)構(gòu)緊湊的抗體形式，如 Fab 片段、單鏈可變區(qū) (scFv) 或單域抗體 (sdAb) 。這類小分子抗體有助于納米顆粒更高效地穿透實體組織或腫瘤^[5]。常見的靶向抗體包括 CD4、CD8、CD3、CD5、CD7 等，它們能夠引導(dǎo) LNP 精準定位至 T 細胞、NK 細胞等特定免疫細胞，從而實現(xiàn)體內(nèi)原位重編程。此外，為降低免疫原性，還會對抗體進行人源化改造，例如將非人源抗體的可變區(qū)嫁接到人源抗體的恒定區(qū)上。

Ab-LNPs 可通過一鍋合成法或后修飾法制備^[5]。

一鍋合成法：是在納米粒形成過程中直接結(jié)合配體-脂質(zhì)偶聯(lián)物，通常采用一鍋合成法將具有強物理化學(xué)穩(wěn)定性和良好水溶性的配體 (如葉酸、甘露糖配體) 納入抗體脂質(zhì)納米顆粒中。

后修飾法：如表面偶聯(lián)和后插入法，常用于將配體引入抗體脂質(zhì)納米顆粒的表面。 (1) 表面偶聯(lián)是指將配體通過共價鍵附著到粒子表面的功能基團上。 (2) 后插入策略則是將預(yù)先形成的脂質(zhì)體或脂質(zhì)納米顆粒與水溶液中的脂質(zhì)配體脂質(zhì)結(jié)合物混合。通過脂質(zhì)插入，配體能夠有效地附著到納米顆粒的表面。

圖 6. Ab-LNP 的制備方法^[5]。

(1) 一鍋合成， (2) 表面偶聯(lián)，以及 (3) 后插入.

此外，還有另一種選擇是將含有點擊化學(xué)官能團的 PEG 化脂質(zhì)膠束插入預(yù)先形成的 LNPs 中，然后通過點擊化學(xué)與修飾的配體反應(yīng)以實現(xiàn)表面偶聯(lián)^[5]。

抗體 (Ab)-LNP 偶聯(lián)藥物通過表面修飾針對 T 細胞特異性配體，將包裹著 CAR-mRNA 的 LNP 精準運送至 T 細胞內(nèi)部 (圖 3A) 。Capstan Therapeutics 公司研發(fā)的 CD8 靶向 CPTX2309 就是一個典型代表^[6]。

(當然，Ab-LNPs 除了可以包載 mRNA，還可以包載化療藥物等。)

CPTX2309 包含一個全人源抗 CD19 CAR mRNA 有效載荷，該載荷被包裹在一個含有新型可電離脂質(zhì)和 CD8 靶向抗體的 tLNP 中，從而能夠有效地將 CAR 轉(zhuǎn)染至 CD8⁺ T 細胞。

圖 7. CPTX2309 示意圖^[6]。

• 體外：CPTX2309 在體外選擇性且高效地將未激活的原代人 CD8⁺ T 細胞改造為功能性 CAR-T 細胞。這些改造后的 CAR-T 細胞表現(xiàn)出可重復(fù)的高 CAR 表達水平，并對自體 B 細胞和 CD19⁺ 細胞系均具有很強的細胞毒性。此外，這些細胞還表現(xiàn)出抗原特異性 T 細胞活化、增殖和多功能性。

• 體內(nèi)：在人源化 NSG-PBMC 小鼠模型中，靜脈注射 CPTX2309 的小鼠表現(xiàn)出 CD8⁺ T 細胞的特異性和高效 CAR 改造，導(dǎo)致治療后 3 小時內(nèi)血液和組織中的 B 細胞迅速且顯著減少。在同一模型中進行的單劑量研究揭示了劑量-效應(yīng)關(guān)系，低至 0.075 mg/kg 的劑量即可清除脾臟中大部分人 B 細胞。此外，研究人員將 CPTX2309 注射到 NSG-CD34⁺ 小鼠體內(nèi)，進一步評估其在具有人 B 細胞重建能力的模型中的療效。每三天重復(fù)給藥一次，劑量為 1.5 mg/kg，共三次，小鼠耐受性良好，顯示出選擇性 CD8⁺ T 細胞工程化作用，并能有效清除血液中所有人 B 細胞。

目前 CPTX2309 正在進行人體臨床試驗 (NCT06917742) ，有望用于治療 B 細胞相關(guān)的自身免疫性疾病。

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