類器官 (organoid) 指的是由干細胞或組織來源細胞在體外培養(yǎng)形成的三維結(jié)構(gòu)，作為一種新興的體外模型，類器官正在改變傳統(tǒng)生命科學研究的方式。

相比傳統(tǒng)的二維細胞培養(yǎng)模型，類器官不僅保留了細胞間的空間組織關(guān)系，還能夠更真實地反映組織的異質(zhì)性和生理狀態(tài)，因此在疾病模型構(gòu)建、藥物篩選以及精準醫(yī)療等領(lǐng)域展現(xiàn)出顯著優(yōu)勢。

圖 1. 類器官與其他模型系統(tǒng)的比較^[1]。

類器官是包含空間分層、細胞異質(zhì)性以及功能分區(qū)的復雜系統(tǒng)，獲取結(jié)構(gòu)信息 (在哪里) 與功能信息 (在做什么) 是非常重要且有挑戰(zhàn)性的工作。

熒光成像正是實現(xiàn)這一目標的核心工具：

• 多色標記可以解析不同細胞群體在三維空間中的分布關(guān)系；

• 功能型探針可以揭示不同區(qū)域的代謝狀態(tài)或信號活性；

• 時間序列成像則可以追蹤類器官在發(fā)育、響應或病理過程中的動態(tài)演變。

熒光技術(shù)并不僅僅能實現(xiàn)“看見類器官"，更關(guān)鍵的是能系統(tǒng)性地讀取其中蘊含的多維生物學信息。

圖 2. Calcein-AM 和 PI 染色的類器官，分別對應活細胞區(qū)域和死細胞區(qū)域^[2]。

然而，隨著研究模型從二維平面轉(zhuǎn)向三維立體，類器官較大的體積、致密的內(nèi)部結(jié)構(gòu)與復雜的三維空間組織，也帶來了新的挑戰(zhàn)——傳統(tǒng)二維體系中成熟的熒光染料與成像策略，并不一定適用于類器官染色實驗。

接下來，我們將對類器官熒光成像實驗中的難點展開詳細分析!

類器官系統(tǒng)中致密的三維結(jié)構(gòu)會顯著限制熒光探針的擴散，尤其在體積較大的類器官中，染料更容易停滯在外圍區(qū)域，中心區(qū)域可能出現(xiàn)染色不足甚至無信號的情況。

關(guān)注染料的組織滲透性，分子量較小、膜通透性更好的熒光探針通常更容易擴散進入類器官內(nèi)部，從而實現(xiàn)更均勻的整體標記。

類器官內(nèi)部結(jié)構(gòu)復雜且不均勻，激發(fā)光和發(fā)射光在傳播過程中容易發(fā)生散射和吸收，導致深層組織的熒光信號減弱，難以準確獲取內(nèi)部區(qū)域的信息。

選擇高亮度、高信噪比、波長靠近紅外區(qū)域的熒光染料，在較低激發(fā)強度下獲得更強信號，減少背景干擾并提升深層成像能力。

類器官研究往往對長期觀察有要求，但連續(xù)激發(fā)引發(fā)光漂白導致信號逐漸減弱，持續(xù)光照誘導 ROS 生成影響類器官狀態(tài)，都是動態(tài)檢測需要考慮的問題。

選擇生物兼容性好、光穩(wěn)定性優(yōu)的染料，提前做好預實驗再開展正式長期觀察，避免浪費樣本。

類器官的培養(yǎng)高度依賴基質(zhì)膠等外部材料，其自發(fā)熒光會帶來不可忽視的背景信號，實際成像中可能熒光信號看起來很亮，但其實信息并不準確來源于類器官本體。

優(yōu)先選擇近紅外波段的染料，減少與自發(fā)熒光的重疊；優(yōu)化培養(yǎng)體系降低自發(fā)熒光，必要時引入自發(fā)熒光淬滅試劑降低背景噪音。

學習完了理論知識，接下來直接上干貨，下面的表格總結(jié)了常見的類器官染料和應用場景，大家可以按需選擇~

表 1. 類器官染料推薦。

熒光成像讓類器官從靜態(tài)培養(yǎng)模型升級為可動態(tài)解析的功能模型，接下來我們結(jié)合兩個經(jīng)典的應用場景，解析類器官染色實驗在實際場景中的價值。

藥物篩選是目前類器官最核心、也是成熟的應用方向之一。

傳統(tǒng)明場觀察往往難以準確區(qū)分類器官內(nèi)部的存活區(qū)域和死亡區(qū)域，藥物處理導致的細胞碎片、結(jié)構(gòu)塌陷也容易影響判斷，而活死細胞熒光染色可以很好地將難以量化的藥物響應轉(zhuǎn)化為可數(shù)據(jù)分析的熒光信號。

隨著高內(nèi)涵成像技術(shù)的發(fā)展，熒光成像已經(jīng)不僅局限于活死分析，還能夠進一步獲取類器官大小、形態(tài)、細胞分布以及藥物響應異質(zhì)性等多維信息，在單個類器官水平上解析不同藥物響應模式。下面這一項研究結(jié)合三種不同的染料分子，實現(xiàn)了同時對類器官結(jié)構(gòu) (Hoechst 33342)、凋亡過程 (Caspase-3/7熒光底物) 和類器官最終死亡情況 (TO-PRO-3) 的原位可視化^[3]。

圖 3. 實驗陽性對照和陰性對照的明場和熒光圖像^[3]。

Hoechst 33342 識別所有細胞，Caspase-3/7 熒光底物識別凋亡細胞，TO-PRO-3 識別所有死亡細胞。

相比傳統(tǒng)二維細胞模型，類器官能夠更真實地保留組織結(jié)構(gòu)和疾病相關(guān)特征，通過熒光成像和動態(tài)觀察，不僅能實現(xiàn)對類器官整體形態(tài)變化的觀察，還可以進一步追蹤細胞的分化和代謝狀態(tài)。

前文已經(jīng)強調(diào)，類器官較大的體積和內(nèi)部光散射對熒光成像實驗影響較大，因此下面介紹的這篇文獻中巧妙引入了雙光子熒光壽命成像 (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy, FLIM) 技術(shù)，一方面雙光子激發(fā)可以提高光穿透能力，降低長時間成像光毒性；另一方面熒光壽命對信號衰減相對不敏感，能提供更穩(wěn)定的信息輸出^[4]。

作者設(shè)計使用 Hoechst 33342對細胞核進行熒光標記，同時將細胞增殖的經(jīng)典標志物 BrdU 摻入復制中的 DNA。BrdU 的積累會導致 Hoechst 熒光發(fā)生淬滅，導致其熒光壽命明顯縮短。對類器官染色的 FLIM 圖像進行 3D 重建數(shù)據(jù)分析，結(jié)果顯示熒光壽命較短的區(qū)域主要對應干細胞富集區(qū)域，即增殖狀態(tài)；而熒光壽命較長的區(qū)域則主要對應已經(jīng)分化或處于靜息狀態(tài)的細胞，即成熟狀態(tài)。這樣的應用使得 Hoechst-BrdU 不僅僅是對細胞核進行熒光標記的染料，更是反映細胞周期狀態(tài)的功能性探針。

圖 4. Hoechst-BrdU 染色類器官雙光子熒光壽命成像 (FLIM) 的三維重建^[4]。

熒光壽命較短的區(qū)域?qū)惼鞴賰?nèi)部增殖狀態(tài)，熒光壽命較長的區(qū)域?qū)惼鞴賰?nèi)部休眠或成熟狀態(tài)。

隨著類器官技術(shù)的持續(xù)發(fā)展，熒光染料的功能定位正逐步拓展。從早期僅用于細胞結(jié)構(gòu)的簡單染色，到如今能夠?qū)崟r追蹤細胞代謝、增殖、分化及動態(tài)行為，熒光成像已逐漸成為類器官研究領(lǐng)域的核心技術(shù)之一。與此同時，類器官模型對熒光染料也提出了更高標準，優(yōu)異的熒光亮度與穩(wěn)定性、低細胞毒性、深層組織穿透能力以及與先進成像技術(shù)的兼容性等，均是類器官染料研發(fā)與應用中需重點考量的關(guān)鍵要素?？梢灶A見，隨著相關(guān)技術(shù)的不斷進步，熒光染料將在類器官研究中發(fā)揮愈發(fā)重要的作用，為疾病機制解析與精準醫(yī)學發(fā)展提供有力支撐。

產(chǎn)品推薦

EthD-1 (HY-D0093)

高親和性的熒光核酸染料，常用于哺乳動物、細菌、酵母和真菌的染色。

參考文獻

[1] Liu GH, et al. A narrative review of organoids for investigatingorgan aging: opportunities and challenges. J Bio-X Res. 2023 May 23; 06 (01)

[2] Garnier G et al. Cationic Cross-Linked Nanocellulose-Based Matrices for the Growth and Recovery of Intestinal Organoids. Biomacromolecules. 2021 Feb 8;22(2):701-709.

[3] Salahudeen AA et al. Protocol for drug screening of patient-derived tumor organoids using high-content fluorescent imaging. STAR Protoc. 2022 May 18;3(2):101407. 

[4] Dmitriev RI et al. Visualization of Stem Cell Niche by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy. Methods Mol Biol. 2020;2171:65-97.