藥物臨床實驗失敗的主要原因包括靶點驗證不足、療效缺乏以及脫靶導(dǎo)致的毒副作用等。因此，現(xiàn)代藥物開發(fā)不僅要求生物活性分子能夠調(diào)節(jié)疾病表型，還應(yīng)明確其分子靶標(biāo)。化合物、靶點和表型可視為臨床前藥物發(fā)現(xiàn)過程的三要素[1]。對于活性分子的未知作用靶點或潛在脫靶效應(yīng)發(fā)現(xiàn)，通常需要通過高通量篩選的方法開展。由于90%以上的藥物靶點為蛋白質(zhì)，因此基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)可在藥物靶點早期發(fā)現(xiàn)方面發(fā)揮重要作用。

圖1. 基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)在臨床前藥物發(fā)現(xiàn)過程中的應(yīng)用[1]（點擊查看大圖）

目前，利用蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行靶點發(fā)現(xiàn)的方法大致可以分為兩種：基于衍生化修飾的化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和利用化合物結(jié)合對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和生物物理特性的影響進(jìn)行分析的方法。

基于衍生化修飾的化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)方法需要首先對目標(biāo)化合物設(shè)計和連接某種探針分子[2]，再根據(jù)探針特點設(shè)計實驗將與化合物結(jié)合的蛋白進(jìn)行富集。該方法存在的問題是前期開發(fā)周期較長，探針可能影響化合物活性構(gòu)象，有些化合物修飾難度較大。

圖2. 基于衍生化修飾的化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)[2]（點擊查看大圖）

利用化合物結(jié)合對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和生物物理特性的影響進(jìn)行分析的方法無需對配體進(jìn)行化學(xué)修飾，包括LiP-MS (蛋白有限水解質(zhì)譜)、TPP (熱蛋白組分析)、SPROX (蛋白質(zhì)氧化速率穩(wěn)定性技術(shù))、TRAP (靶向響應(yīng)可及性)等。

其中，Lip-MS[3]的設(shè)計原理基于蛋白與配體結(jié)合后，暴露不同的廣譜蛋白酶酶切位點，產(chǎn)生不同的蛋白酶切片段。中科院大連化物所葉明亮團(tuán)隊開發(fā)的PELSA[4]方法可同時高靈敏鑒定配體結(jié)合蛋白和結(jié)合位點，近期還入選了首屆“中國蛋白質(zhì)組學(xué)十大進(jìn)展”。

圖3. Lip-MS技術(shù)[3]（點擊查看大圖）

圖4. PELSA技術(shù)[4]（點擊查看大圖）

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TPP[5]的設(shè)計原理是利用蛋白隨溫度升高發(fā)生降解，當(dāng)結(jié)合藥物后，相同溫度下未降解蛋白的量會提高，該復(fù)合蛋白的熱熔曲線會右移。該方法還可用于活細(xì)胞水平的藥物靶點篩選。Gaetani[6]等在TPP的基礎(chǔ)上，開發(fā)了PISA方法，將不同溫度處理的樣品混合后定量檢測，極大降低了樣本檢測數(shù)。每種藥物靶點篩選方法都有各自的優(yōu)勢和不足，需根據(jù)應(yīng)用場景選擇適合的一種或多種方法結(jié)合分析。

圖5. TPP技術(shù)[5]（點擊查看大圖）

圖6. PISA技術(shù)[6]（點擊查看大圖）

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由于很多靶標(biāo)蛋白在體內(nèi)含量較低，且蛋白與配體結(jié)合后可檢測的變化差異往往也較小，這就需要后續(xù)的質(zhì)譜檢測方法提供盡可能高的蛋白檢測靈敏度和定量準(zhǔn)確性。以PISA為例，該方法雖然極大簡化了TPP實驗流程和樣本量，但由于將不同溫度點樣本合并，ΔSm反映出的定量差異往往更小。因此，以往檢測常采用TMT標(biāo)記后分多個餾分，再對每個餾分進(jìn)行長梯度LC-MS分析。TMT標(biāo)記對于不熟悉蛋白組學(xué)樣品前處理的研究者來說還是具有比較大的挑戰(zhàn)。近年來，隨著質(zhì)譜技術(shù)和AI算法的進(jìn)步，DIA采集和分析策略方面都取得了進(jìn)展。尤其是Orbitrap Astral質(zhì)譜儀，可實現(xiàn)2-Th窄窗口式數(shù)據(jù)非依賴性采集(nDIA)，在蛋白質(zhì)組鑒定深度、數(shù)據(jù)完整性、定量精度和通量方面都表現(xiàn)優(yōu)異。

我們以具有明確靶點的藥物甲氨蝶呤(MTX)為例進(jìn)行了Astral PISA-DIA測試，分別將DMSO或2mM MTX與人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1裂解液孵育，并在45-60℃范圍內(nèi)進(jìn)行6個不同溫度加熱處理，合并加熱后樣本，轉(zhuǎn)移上清進(jìn)行常規(guī)label free蛋白組學(xué)前處理，之后通過23分鐘梯度的Astral nDIA方法進(jìn)行檢測；各組設(shè)置3個重復(fù)。本次測試使用DIA-NN軟件分析，共定量7380個蛋白組；以差異倍數(shù)(FC) 1.5、p＜0.05閾值，共篩選出248個上調(diào)和368個下調(diào)蛋白；MTX的已知靶點DHFR顯著性變化在本次測試中也明確鑒定到。

與傳統(tǒng)PISA-TMT相比，Astral PISA-DIA顯著簡化了樣本制備流程，并在極大縮短檢測時間的前提下可得到理想的鑒定結(jié)果。這也將使實際研究中進(jìn)行不同藥物濃度和加熱溫度等實驗條件對比優(yōu)化更加便捷。

圖7. Orbitrap Astral PISA-DIA測試結(jié)果 （點擊查看大圖）

在蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)方面，Orbitrap Astral展示出強大的檢測通量和覆蓋深度，已使開展大規(guī)模的臨床樣本檢測、發(fā)現(xiàn)新的潛在生物學(xué)標(biāo)志物成為可能，助力疾病診斷更精準(zhǔn)。在藥物早期發(fā)現(xiàn)階段，結(jié)合多種靶點發(fā)現(xiàn)方法和Astral的優(yōu)異性能，也將更好的助力新化合物靶點發(fā)現(xiàn)、藥物新作用靶點篩選、脫靶風(fēng)險評估等研究，進(jìn)而加速整體藥物研發(fā)進(jìn)程和降低后期臨床失敗風(fēng)險。

圖8. Orbitrap Astral助力藥物靶點發(fā)現(xiàn)研究（點擊查看大圖）

參考文獻(xiàn)：

1. Meissner F, Geddes-McAlister J, Mann M, et al. The emerging role of mass spectrometry-based proteomics in drug discovery[J]. Nature Reviews Drug Discovery, 2022, 21(9): 637-654.

2. Chen X, Wang Y, Ma N, et al. Target identification of natural medicine with chemical proteomics approach: probe synthesis, target fishing and protein identification[J]. Signal Transduction and Targeted Therapy, 2020, 5(1): 72.

3. Malinovska L, Cappelletti V, Kohler D, et al. Proteome-wide structural changes measured with limited proteolysis-mass spectrometry: an advanced protocol for high-throughput applications[J]. Nature Protocols, 2023, 18(3): 659-682.

4. Li K, Chen S, Wang K, et al. A peptide-centric local stability assay enables proteome-scale identification of the protein targets and binding regions of diverse ligands[J]. Nature Methods, 2025, 22(2): 278-282.

5. Franken H, Mathieson T, Childs D, et al. Thermal proteome profiling for unbiased identification of direct and indirect drug targets using multiplexed quantitative mass spectrometry[J]. Nature protocols, 2015, 10(10): 1567-1593.

6. Gaetani M, Sabatier P, Saei A A, et al. Proteome integral solubility alteration: a high-throughput proteomics assay for target deconvolution[J]. Journal of proteome research, 2019, 18(11): 4027-4037.

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