■ 產(chǎn)品簡(jiǎn)介

Rosetta 2(DE3) pLysS來(lái)源于Rosetta(DE3)，本菌株含有pRARE2質(zhì)粒，除了能夠提供原Rosetta(DE3)宿主菌含有的AUA，AGG，AGA，CUA，CCC和GGA六個(gè)稀有密碼子的tRNA外，還提供了第七個(gè)稀有密碼子CGG的tRNA。同時(shí)，pRARE2質(zhì)粒具有氯霉素抗性。Rosetta2(DE3) pLysS載體通過(guò)提供稀有密碼子，使得該宿主菌相對(duì)于其他大腸桿菌，能夠提供更加“通用"的蛋白質(zhì)表達(dá)，從而提升目的蛋白表達(dá)水平。DE3是溶源性的λDE3，所以帶有T7 RNA聚合酶的染色體拷貝，因此適用于pET系列載體及其他T7啟動(dòng)子系列載體。該菌株含有pLysS基因，能夠產(chǎn)生T7溶菌酶，可以有效降低目的基因的基礎(chǔ)表達(dá)水平。 pLysS質(zhì)粒的起始復(fù)制位點(diǎn)是p15 Origin，這使得該質(zhì)粒能夠和pUC-及pBR322-衍生的質(zhì)粒互相共存。經(jīng)pUC19質(zhì)粒轉(zhuǎn)化檢測(cè)，Rosetta2(DE3) pLysS感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率可達(dá)107 cfu/μg DNA以上。

■ 產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)

● 高轉(zhuǎn)化效率：>1×107 cfu/µg pUC19 DNA
● 大大提高外源基因(特別是真核基因)在原核系統(tǒng)中的表達(dá)水平
● 降低目的基因的本底水平表達(dá)

■ 產(chǎn)品組成

基因型: F- ompT hsdSB (rB- mB-) gal dcm (DE3) pLysSRARE2 (CamR)

■ 產(chǎn)品應(yīng)用

Rosetta 2(DE3) pLysS感受態(tài)細(xì)胞適用于外源基因(特別是真核基因)在原核系統(tǒng)中的T7表達(dá)。

■ 存儲(chǔ)條件

-80℃保存；請(qǐng)勿將本品置于-20℃或者液氮中保存!

■ 使用方法

1. 解凍感受態(tài)細(xì)胞：從-80 ℃取出感受態(tài)細(xì)胞，冰上融化約5-10 min，然后立即進(jìn)行DNA樣品的轉(zhuǎn)化。

2. DNA樣品的轉(zhuǎn)化：每100 μL感受態(tài)可加入0.5-10 μL待轉(zhuǎn)化DNA樣品（例如質(zhì)粒、連接產(chǎn)物或重組產(chǎn)物等），然后輕輕彈擊管底約5-6次，立即冰上靜置孵育30 min。

• 待轉(zhuǎn)化DNA樣品的加入體積不宜超過(guò)感受態(tài)細(xì)胞體積的1/10。

• 加入待轉(zhuǎn)化DNA樣品后應(yīng)輕柔彈擊混勻，避免使用移液槍劇烈吹打混勻。

• 用于質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化時(shí)可將冰浴時(shí)間縮短至5-10 min；用于連接產(chǎn)物或重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化時(shí)，建議冰浴時(shí)間為15-30 min以提高轉(zhuǎn)化效率。

3. 熱激處理：冰浴后，將裝有感受態(tài)和DNA樣品的的離心管快速置于42℃水浴中，靜置熱激90 s。隨后立即轉(zhuǎn)移至冰上靜置2-3 min以快速冷卻。

• 熱激時(shí)間需要精確控制在45-90 s。

• 熱激及轉(zhuǎn)移至冰浴過(guò)程中禁止晃動(dòng)離心管。

4. 復(fù)蘇培養(yǎng)：加入900 μL 室溫或37 ℃預(yù)熱的LB培養(yǎng)基（或SOC培養(yǎng)基等），上下顛倒數(shù)次混勻，然后將離心管傾斜放置在恒溫?fù)u床中，37℃ 220 rpm復(fù)蘇培養(yǎng)45 min。

• 37℃為常規(guī)復(fù)蘇溫度，若轉(zhuǎn)入質(zhì)粒對(duì)溫度敏感或其它特殊情況需根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求設(shè)置合適的溫度。

5. 收菌涂板：用于質(zhì)粒轉(zhuǎn)化時(shí)，復(fù)蘇后可直接取50-100 μL菌液涂板；用于連接產(chǎn)物或重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化時(shí)，建議先5000 g，1 min室溫離心，吸棄約900 μL上清，然后用剩余的約100 μL重懸菌液，涂布到含相應(yīng)抗生素的LB平板上。

6. 過(guò)夜培養(yǎng)：將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜。

• 培養(yǎng)前需要將平板在超凈臺(tái)中稍微晾至無(wú)明顯水漬，有利于形成單克隆。

• 37℃為常規(guī)培養(yǎng)溫度，若轉(zhuǎn)入質(zhì)粒對(duì)溫度敏感或其它特殊情況需根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求設(shè)置合適的溫度。

■ 相關(guān)參數(shù)